Proteómica
La plataforma de Secuenciación y Tecnologías Omicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile ofrece sus servicios para realizar preparación, adquisición de datos y análisis de datos en experimentos de proteómica
El término proteómica se relaciona al estudio de las proteoformas presentes en una muestra de interés, y se puede realizar mediante metodos dirigidos y no dirigidos. Si bien existen formas experimentales para determinar proteomica cuantitativa, ciertos metodos podrían realizarse en los equipos disponibles. En ese aspecto, sugerimos escribir a espectro.masas@bio.puc.cl para contactarse directamente con el servicio.
Preparación de muestras
El servicio ofrece las siguientes maneras de realizar la preparación de muestras:
Concentración: Utilizando el fluorómetro Qubit, se puede determinar la concentración de proteína de las muestras recibidas.
Intercambio de buffer: Los buffers utilizados comúnmente en ciencias biológicas no son compatibles con espectrometría de masas, por lo que al recibir una muestra en solución, ésta debe ser intercambiada por algún buffer volátil, mediante concentradores capaces de retener toda proteína con una masa mayor a 10kDa.
Digestión en gel: realizado a muestras recibidas en gel o bandas de gel de poliacrilamida con tinción de Coomassie coloidal.
Digestión en solución: realizado a muestras proteicas recibidas en algún buffer liquido, donde la denaturación, alquilación y digestión ocurre en el mismo liquido agregándose reactivos secuencialmente.
Filter-aided sample preparation (FASP): Esta preparación es una alternativa a la digestión en solución y requiere de un filtro plano de 10kDa (ej: Microcon) donde se realiza el lavado, concentración, intercambio de buffer y digestión de la muestra. Una vez digerida, los péptidos obtenidos se recuperan por centrifugación.
Desalting y limpieza de Péptidos: Una vez digerida la muestra, se realiza una limpieza a los péptidos generados, eliminando sales y contaminantes mediante el uso de puntas de pipeta o columnas con resina C18.
Proteómica Bottom-up
Este metodo permite obtener un perfil proteomico de la muestra y una identificación general de las proteínas en ésta.
La separación se realiza en una columna HPLC C18 de 1mm de diametro y 25cm de largo, donde se separa hasta 10 microgramos por adquisición, en un gradiente que va entre 60 a 120 minutos.
La identificación de proteinas se realiza utilizando la base de datos de proteinas de una especie en particular, obtenida de fuentes como UniProt, y trabajando con MaxQuant y/o con el TransProteomic Pipeline, ambos softwares gratuitos.
Proteómica Top-Down
En este método, la proteína purificada se inyecta directamente y se selecciona el peak mas abundante, el cual se va fragmentando al aumentar gradualmente su energía interna y obteniendo diversos péptidos.
Para obtener secuencia de esos péptidos, se puede someter a la muestra a una fragmentación inicial, donde los diferentes péptidos se seleccionan y fragmentan obteniendo un patrón de fragmentación.
Análisis de datos
Los datos obtenidos son analizados mediante softwares gratuitos, como Skyline, MaxQuant y TransProteomic Pipeline.