Metabolómica y Lipidómica

La plataforma de Secuenciación y Tecnologías Omicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile ofrece sus servicios para realizar preparación, adquisición de datos y análisis de datos en las áreas de metabolómica y lipidómica

El término metabolómica suele agrupar a todos los metabolitos presentes en una muestra, y la lipidómica es un subconjunto de ésta, que suele obtener su propia clasificación por la importancia de lípidos y esteroles como interfase entre el extracelular e intracelular, ademas de su constante interacción con proteínas de membranas y como moléculas de señalización. Por eso uno encuentra ambos términos en la literatura, sin embargo sus métodos de estudio y protocolos, como los presentados acá, suelen ser bastante similares entre ambas disciplinas.

Las formas de estudiar todos estos metabolitos se pueden clasificar en métodos dirigidos (targeted metabolomics) y no-dirigidos (untargeted metabolomics). Además, se pueden estudiar de forma cualitativa y también de manera cuantitativa.

Preparación de muestras

Para la extracción de metabolitos, se utilizan métodos liquido-liquido, con mezclas de fases orgánicas que permiten hacer una extracción general, o bien extracciones separadas para metabolitos polares y apolares

Extracciones Generales: Las extracciones realizadas con Metanol frío y con mezcla Acetonitrilo:Isopropanol:Agua pueden recuperar una amplia gama de moléculas que van desde aminoacidos hasta triglicéridos.
Extracciones Bifasicas: Estas extracciones separan metabolitos polares de los apolares mediante fases. En en servicio se ofrece la extracción MTBE:Metanol (una alternativa menos toxica de Metanol:Cloroformo) que permite extraer metabolitos polares y apolares en dos fases diferentes, donde el cell debris y las proteínas son precipitadas evitando contaminación de éstos al extraer las fases del tubo.
Extracciones Multiomicas: Estas preparaciones buscan recuperar metabolitos y proteínas desde una misma muestra para realizar experimentos multiomicos de proteomica y metabolomica. Acá se encuentran los protocolos Simplex y MPlex
Extracción en fase sólida (SPE): Este paso representa una limpieza de la muestra extraída de contaminantes, residuos originales de muestra que afecten la adquisición de datos, polvo, etc.

Metabolómica No-Dirigida

Esta forma busca identificar la mayor cantidad de metabolitos posibles en una o varias muestras, utilizando metodos generales de extracción de moleculas e identificandolas a partir de comparaciones con librerías espectrales (GNPS, MoNA, etc) y con análisis estadisticos detectar diferencias entre distintos grupos o tratamientos que sea interesante estudiar.

Metabolómica Dirigida

Este método busca estudiar una molécula en particular o un pequeño grupo de moléculas. Se suele realizar después de identificar posibles biomarcadores de interés en métodos no-dirigidos para realizar comparaciones en el nivel de presencia que se pueda detectar en las muestras, por lo que esta muy relacionado con cuantificaciones relativas y absolutas de metabolitos. Para este método se utiliza MRM (multiple reaction monitoring) en un espectrómetro de tipo triple cuadrupolo o PRM (parallel reaction monitoring) en un espectrómetro Q-TOF u Orbitrap.

Metabolomica No-Dirigida

Metodo de descubrimiento
Generador de hipótesis
Análisis global
MS/MS se correlaciona con librerías espectrales
Identificación cualitativa
Cuantificación relativa

Metabolomica Dirigida

Metodo de validación
Motivado por hipótesis
Analisis local
MS/MS se correlaciona con estándares de referencia
La identificación ya es conocida
Cuantificación absoluta

Análisis de Datos

Para realizar el análisis de datos, se utilizan software enfocados en esos resultados. Mas información la pueden encontrar en la pagina de softwares

Métodos cuantitativos

Realizar experimentos en metabolómica o lipidómica cuantitativa requiere del uso de algún estándar de referencia, el cual puede ser una forma pura del metabolito de estudio, o una versión modificada de éste (ya sea por Carbono-13 o deuterada).

Existen 3 maneras de cuantificar en Metabolomica/Lipidomica:

Curva de Referencia

Con el estándar puro del compuesto, se realiza una dilución seriada, y se desarrolla un método de espectrometría de masas, que permita generar una curva de concentración, que muestre una relación lineal entre la cantidad inyectada y la señal obtenida del espectrómetro.

El estandar puro del compuesto, debe ser entregado por el usuario del servicio.

Estandar Interno: Isotopo

Requiere la compra de un estandar SIL (stable isotope labelling), que es una version isotopica de la molecula de interes. Este marcaje isotopico puede ser mediante deuterio o mediante el reemplazo de carbonos por C-13.

El estándar SIL, es agregado en una misma cantidad a cada muestra en el proceso inicial de extracción de metabolitos.

Como la molécula es idéntica a la original, apareceran al mismo tiempo en una corrida LC-MS/MS, y al comparar las señales entre la molecula original dentro de la muestra vs el estandar SIL, se obtiene la concentracion de la molecula de interés.

Estandar Interno: Similar

En el caso que uno busque cuantificar varias moleculas similares, pero no tiene presupuesto para comprar los estándares, una ultima opción puede ser utilizar como estándar interno, una molécula similar que no exista naturalmente en tu muestra.

Sin embargo, mas que cuantificar de manera absoluta, se obtiene una cuantificación relativa a este estándar interno, como una forma de estandarizar un grupo de moleculas.

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