preprinkaihack2017

Apr 18 (Tue) - 20 (Thu), 2017

Preparatory Experiments for the Rinkai-Hackathon-2017 @ UMI-UOkayama/ 臨海ハッカソン2017用の予備実験＠岡山大学 牛窓臨海

Venue / 開催場所

Ushimado Marine Institute, Okayama Univ. / 岡山大学 牛窓臨海実験所

Application Method / 応募方法

This event "PrepRinkaihack" covers only the members of the Acting Committee and the Advisory Staffs of "RinkaiHack", and does not offer public invitations for participation. If you are interested to join, please contact to the Acting Committee directly or contact us from the "Contact" page. / このイベント"PrepRinkaihack"は当研究会"RinkaiHack"の運営メンバーのみを対象としており、参加の一般公募を行なっていません。興味のある方は運営委員に直接問い合わせるか、問い合わせページからお問い合わせください。

Participants / 参加者：

Acting Committee / 運営委員

Takeshi Kawashima / 川島武士 / かわしまたけし  (国立遺伝学研究所) 

Masaaki Yoshida / 吉田真明 / よしだまさあき (島根大学隠岐臨海)  

Mayuko Hamada / 濱田麻友子 / はまだまゆこ (岡山大学牛窓臨海)    

Advisory Staffs / 運営アドバイザー

Yoshiaki Morino / 守野孔明 / もりの よしあき (筑波大学) 

Special Guest / 特別参加

Shigeki Fujiwara / 藤原滋樹 / ふじわらしげき （高知大学）

Collaboration / 協力

Tatsuya Sakamoto / 坂本竜哉 / さかもとたつや （岡山大学・牛窓臨海実験所長、全国国立大学臨海臨湖実験所所長会議・議長）

Naoaki Tsutsui / 筒井 直昭 / つつい なおあき (岡山大学・牛窓臨海所実験所)

Non-participation Supporters / 応援

Shigehiro Kuraku / 工樂樹洋 / くらく しげひろ (理化学研究所)

Akira Satou / 佐藤伸 / さとうあきら (岡山大学)

Participation report / 参加報告

PrepRinkaihack2017は、4月18日-20日の二泊三日で行われました。工樂さんと佐藤さんは、当初参加予定が多忙のためキャンセルとなりましたが、応援のコメントをいただきました。運営委員のうち、川島は体調不良のために二日目からの参加となりました。

初日はMinIONの利用に必要なソフトウェアであるMinKNOWやDeskTopAgentのインストールやらその設定やらに苦心しましたが、初日メンバーの粘りで見事クリア。二日目にコントロール用のラムダDNAの配列解読を開始しました。夜にはヒドラのゲノム配列の解読を開始。初日と同じ作業の部分はさすがに時間をかけずにクリアしましたが、同じフローセルを使い回すために作業で、またもや苦難。ともかく二回めもRunも始まった（続く）

三日目朝。ラムダDNAの方のBaseCallは続いているようだ。WindowsMachine上で走っているヒドラゲノムDNAの配列解析も続いている。すでにフォルダ名0と1ができているので、パソコンが落ちないことを願いつつ恐る恐るフォルダ名0からfast5形式のreadファイルを3つばかり取得し、別のパソコンに移した。次の難関はfast5からfastqへの変換。

見つけた手法は4つ

R_poRe: An R package to enable visualisation of nanopore sequencing data

https://sourceforge.net/projects/rpore/

IONiseR: IONiseR provides tools for the quality assessment of Oxford Nanopore MinION data.

https://rdrr.io/bioc/IONiseR/

Poretools: a toolkit for working with Oxford Nanopore data

https://github.com/arq5x/poretools

Fast5 Extraction Tool 

https://github.com/gringer/bioinfscripts/blob/master/fast5extractor.py

ラムダDNA 6時間runで、約16万reads.

ヒドラ（フローセル使い回し）10時間runで、約6万readsで終了（詰まったか？）。最長は1read 100kb程度。

仲木さんたちと電話会議。

三日目は 2時前終了、解散。

TODO

本番の持ち物のチェック表を作る (チップ 等・消耗品の振り分けも)。

今回の復習と準備会議の日程を確定。

SSDに積み替えたWindowsをアップデートを済ませた上で最終test runを行う。(H. viridissima by 濱田)

SSD積み替え後が何台つかえるかcheck。持ち込みサンプル数の律速。合わせてminION本体の貸出数を相談。

NGS現場の会のポスターに間に合うように、Prep hackのデータを使って解析スタートする。 (by 吉田)

Local BaseCaller (Albacore、もしくは別の)のテスト。

5/8参加者確定後のRegister mailの原案を作成する。

・全参加者の実験ノート・気付きをGoogle Doc等を使って

・持ち込みDNAの条件をまとめて、分かりやすく明記する。

・Wrightthon参加者募集、持ち込みDNAで得られたdataで論文を考える場合の協力者を募集する。条件(データ公開や等)を明記する。

参加者の感想、雑感

・minIONすごーい！たーのしー^^

・Libraryをflow cellにloadするところは時間が非常にシビアでバタバタする。runはminION１台ずつスタートさせた方がよさそう。具体的には、５班あるなら１班がloadし終わってrun startしてから、２班に進む、など。

・Flow cellを洗って使い回しするのは鬼門。Runをスタートしたあとはデータを取りきるまでなるべく触らない方が吉。

・机をガタガタ揺らすなどのことはRunには(おそらく)問題なかった。物理的撹乱に強い印象。

・マニュアルを読んだだけで全くの初学者がRunまでこぎつけられてそれなりのデータを得られる簡便さが凄い

・MinKnow周り

・MinKnowはrobustだが、表示がおかしくなることが多い。それでもworkしているの放置推奨。

・標準出力先は

Mac

home/Library/MinKNOW/data/reads

Win

C:\Program Files\data\reads

・Live Base Call でランするとreadsの中にpass, fail, skip, tempのフォルダができる。basecall後のデータはpass, fail, skipに振り分けられる。それぞれ以下に対応

◦ Workflow successful - the read has been successfully basecalled

◦ FailedBasecall - the basecall failed, for example if the q-score was too low

◦ FailedNoOutput - the basecall algorithm did not return a valid result

◦ FailedForceSkipped - the algorithm had to skip the read because there were not enough compute resources to process it

・Non Base Callingでランするとreadsの中に番号のついた（0, 1, 2 …)フォルダができてその中にbasecallされてないfast5がそのまま入る。BaseCallsするには、Albacorecore basecalling software

https://community.nanoporetech.com/protocols/albacore-offline-basecalli/v/abec_2003_v1_revn_29nov201

・"stop acquire" buttonでrunを止められる。base callが終わっていなければ自動的にCatch up modeになってbase callを継続。runで出てきた生readは、すべてbase callのqueued readになるようだ。

・Catch up modeはqueued readがすべて終わると自動的に終了。強制終了(☓)以外に止める方法はない。再runやpore groupsの自動組み換え後は最初から始まる。

・Catch up modeでbase callされなかったqueued readはtempかskipどっちに入る(どちらにもfast5が入っていて今のところ不明）。再度BaseCallsするには、Albacorecore basecalling softwareなどを使う。

・Live BaseCallは非常に時間がかかる。Runの２倍以上。

・日本語開催報告+ヒドラWrightThonに続く３番めの論文を考える。Regional science of Marine Science？

・DNAの準備の前(第０日)にやっておくべきこと

PCのセットアップ

1. SleepをNeverにする

2. Windows updateを完了しておく

3. Compatibility Test

＜インプットDNAのクオリティのNanopore推奨値＞

長さ: >30 kb

260/280: 1.8～

260/230: 2.0～

＜ヒドラ（H.magnipapillataとH. viridissima A99）のgDNA抽出方法＞

１週間絶食＆抗生物質処理したヒドラそれぞれ50匹(H.magnipapillata)と150匹（共生クロレラ除去済みH.viridissima)

→ QIAGEN Blood & Cell Culture DNA Mini Kit Genomic Tip 20/G

→ イソプロパノールで沈殿

→ 70% EtOHでwash *3

→ dry up

→ 50~80µlのTEに溶かす

→ NanodropとQubitで濃度測定。電気泳動で長さチェック（サンプル：2 µl 使用、マーカー：ニッポンジーンMarker 8 GT 0.5 µg 使用、泳動条件：0.3% Agarose H、1% TAE buffer、50V 、2.5 hours）