前置準備：

1.先用酒精噴瓶與拭鏡纸將短玻璃和厚玻璃擦拭乾淨

2.使用洗瓶ddH₂O測試膠台，用長圖畫紙把水吸乾

3.於離心管中配置resolving gel（下膠）並加入7.2mL的量

步驟：

製作下膠（resolving gel ）：

1.H₂O：4.6 mL

2.29% Acrylamide Mix（成膠的基本單位—孔洞形成）：2.7 mL

3.1.5 M Tris（pH 8.8）（維持溶液的電中性及pH）：2.5 mL

4.10% SDS（界面活性劑，使蛋白質變性均帶負電）：100 μL

5.1%TCE（2,2,2-Trichloroethanotl）（受到300mm波長激發產生可見光—膠體染色）：100 μL

6.TEMED（幫助傳遞自由基的催化劑）：6μL

7.10% Ammonium Persulfate （APS）（自由基的提供者）：100 μL

製作上膠（stacking gel）：

1.H₂O：3.4 mL

2.29% Acrylamide Mix：830μL

3.1.0 M Tris （pH6.9）：630 μL

4.10% SDS：50μL

5.10% Ammonium Persulfate（最後加）：50μL

6.TEMED（催化劑 最後加）：5 μL

跑膠（Gel Running）

將上午製備的蛋白質膠體拆下來，於水槽邊操作，邊拆邊沖水，將齒梳拆下來，並沖水將well的泡泡沖乾淨。用夾子將膠體夾於電泳槽內，並加入1X running buffer於槽中。

        我們原先認為今天的實驗會和前幾次製作PCR 電泳差異不大，都是類似的內容，但是今天的課課卻讓我們一再地遭受到挫折與驚嚇。午餐前我們就完成了膠體的配置，倒入模具等待他凝固，但當我們下午要進行實驗時，卻發現上膠僅有一部份凝固，厚度不足以致無法使用。在我們嘗試重新配置後仍然無法凝固，這壤我們十分疑惑，也大大減少我們的自信。嘗試無果後因時間的關係，我們使用隔壁組的膠進行電泳。更令人洩氣的是，在我們進將近一小時的電泳後，我們將樣品拿去照燈，在燈下卻看不到沒有任何結果。回到實驗室中，指導我們進行實驗的助教請我們分析這次實驗失敗的原因，我們認為上膠製作會失敗的原因是因為我們沒有把防止下膠凝固的水吸乾造成，但我們的實驗中有部分的膠是有凝固的。在此，我們的討論便陷入停頓。雖然討論無果，但我們一致認為下次進行實驗時可以嘗試增加 TEMED 的量或是濃度，因為 TEMED 在製膠中扮演催化劑的角色，增加 TEMED 的量可能可以讓上膠更容易凝固。而電泳的部份我們則認為增加樣本的量或許可以改善這個問題。這次實驗或許不如往常般順利、完整，但想到教授們和其他研究員可能經常遇到這些實驗失敗的時候，而他們也是這樣，找出問題，嘗試各種解決辦法。這也讓我們理解這才是我們參加人才培訓最初的目的——體驗到最真實的實驗。

07.11（四）

資訊來源：

上課講義