Embedded Files
微生物
微生物簡介
什麼是微生物？
肉眼無法看見的生物體，體長介在2~0.2μm。不過因為近代科學的發達，也有發現極大（華麗琉珠菌 1cm）或極小（200nm）的微生物，使得這個分界變得較模糊。
微生物染色
大腸桿菌
大腸桿菌
大腸桿菌+枯草桿菌
大腸桿菌+枯草桿菌
簡單染色（Simple staining）
實驗原理：
利用帶正電的單種染劑，觀察菌體型態。
實驗步驟：
菌種：大腸桿菌
1.使用熱固定法製備細菌抹片
2.使用Crystal violet（結晶紫）停留於細菌上40秒
3.後用二次水沖洗（清洗多餘的染劑）
4.使用擦手紙將玻片擦乾（切勿對著菌體擦拭）
5.顯微鏡下觀察，必須使用100X油鏡，並拍照記錄型態
格蘭氏染色（Gram′s staining）
實驗原理：
格蘭氏染色是由一位丹麥醫生漢斯．克裡斯蒂安．格蘭於1884年所發明，因細菌細胞壁所構成的成份不同，利用這種染色法，可初步鑑辨細菌
格蘭氏陽性菌：細胞壁肽聚醣層較厚，染劑保留在菌體內呈現紫色或藍紫色
格蘭氏陰性菌：細胞壁肽聚醣層較薄，染劑不易保留在菌體內所以呈現红色
實驗步驟：
菌種：大腸桿菌G（-）、枯草桿菌G（+）
1.使用熱固定法製備細菌抹片
2.初染—結晶紫（crystal violet），10秒後用二次水沖洗，擦手纸拍乾
3.媒染—碘液（Gram's iodine），10秒後用二次水沖洗
4.去色—95%酒精，洗至沒有染劑顏色流出，10秒後用二次水沖洗
5.回染—番紅（safranin），10秒後用二次水沖洗
6.蓋上蓋玻片後使用顯微鏡觀察，100X鏡頭需使用鏡油觀察
100X
40X
微生物觀察
劃線法（streak-plate method）
1.接種環在酒精燈上以火焰燒紅後，冷卻
2.接種環沾取單一菌落後開始塗培養基，以鋸齒狀畫於培養基
上（重複3次，接種環每次都需燒紅、冷卻，全程無菌狀態）
3.將培養皿倒置於37°C培養箱中培養16小時
4.隔天觀察结果
▼接種環在酒精燈上以火焰燒紅
▼劃線法（第一次～第三次）
塗抹法（spread-plate method）
1.將稀釋的菌液取100μL，
加在已凝固的培養基上
2.三角玻璃棒在95%酒精中
浸泡，取出過火，冷卻後
在培養基上來回塗抹，確
保菌株能在培養基上均勻
分布
3.塗抹均勻後將玻璃棒過
火，放回95%酒精中。
4.將培養皿倒置於37°C培養
箱中培養16小時，隔天觀
察結果並計算菌落數
▲ 菌落數：82
液態培養（broth method）
1.P200接tip，沾取單一菌落
2.僅tip尖端伸入離心管，將tip退入至
培養液，蓋回蓋子（全程無菌狀
態）
3.將離心管置於37°C培養箱中，震盪
培養16小時，隔天觀察結果
抑制性實驗
紫外光照射
▲照射0分鐘紫外線（菌落數82）
▲照射5分鐘紫外線（菌落數35）
▲照射20分鐘紫外線（菌落數1）
化學藥劑感受性實驗
菌種：大腸桿菌
化學藥劑：抑菌園直徑／抑菌強度
Ampicillin (10 mg/ml)：14mm／中度抑制
蒜頭萃取液：17mm／高度抑制
70%酒精：0mm／無抑制
10%漂白水：13mm／中度抑制
漱口水：15mm／中度抑制
無菌水：0mm／無抑制
市售飲料菌含量實驗
▲集氣管有氣泡表飲料內含微生物（別組）
▲集氣管沒有氣泡表飲料內無微生物（本組）
▲集氣管沒有氣泡表飲料內無微生物（本組）
問題討論
Q：如何製作一個耐高溫的培養基?
A：添加熱穩定劑，如氨基酸或胺類化合物，保證菌株在高溫下生長。
Q： 一個酵母菌最多能有幾個芽痕(bud scars)?
A：20個
Q：為什麼幽門螺旋桿菌可以生活在胃的極端環境中?
A：幽門螺旋桿菌能夠在胃酸強烈的環境中生存，主要依賴其高度的酸耐性和強大的粘附能力。它具備尿素酶來中和胃酸，並且能夠利用其螺旋形態在胃黏液層中移動，有效避開胃酸的侵襲，這些特徵使得它能夠在這樣極端的生存條件下存活。
Q：做益生菌的時候需要注意什麼才能使其通過人體的重重關卡?
A：人體中的酸鹼值和鹽度。
心得
原先以為課程會像在學校進行時一樣，只是用顯微鏡觀察微生物的型態，但這一次卻是由我們從頭到尾完成這次實驗。一開始使用藥劑將大腸桿菌染色以便觀察，要戴上手套防止化學藥劑沾到皮膚，小心操作避免濺出或發生意外，隨後在顯微鏡下慢慢調整倍率，大腸桿菌的構造也愈發清晰明朗。到了100倍時由於物鏡會直接緊貼在玻片上，因此需要抹上鏡油以聚光來觀察。
接著我們以劃線法、塗抹法、液態培養法培養微生物，這些都是第一次進行的實驗。劃線法需在火焰上燒紅接種環，並在培養基上以鋸齒狀劃線三次，每次開頭都要接續前一次的最尾端；塗抹法相較起來則簡單許多，將三角玻璃棒浸泡95%酒精後過火，冷卻後在培養基表面均勻塗抹，確保每一寸都能沾染菌液，我們用這個方法製作了四個培養皿，操作變因為紫外線的照射分別是0、5、20分鐘，剩餘的一個則是用油性筆點出正六邊形的六個點，分別滴上六種液體觀察其變化；液態培養則是在前一天助教要求我們準備的清華校園內的飲料，我們這組是用早餐店的紅茶來實驗，Pipetman接tip後沾取單一菌落，將其尖端伸入離心管，將tip退入至培養液，蓋回蓋子。隨後將培養皿倒置於37°C培養箱中培養16小時，液態培養法則是將離心管置於相同溫度的培養箱中同樣時間，需要注意的是這裡要放入儀器中震盪培養。
紫外光照射（抑制性實驗）的結果是沒照射紫外線的菌落數最多，證明陽光確實有殺菌作用；化學藥劑感受性實驗的結果屬實震驚到我，像是70%酒精竟然是無抑制狀態，顛覆我以往的認知；另外市售飲料菌含量實驗中，我們這組的早餐店紅茶十分乾淨沒有細菌，事實上十組裡只有一組有氣泡，看來食安方面還是沒有太大的問題。
這次的實驗雖然不需要太艱難的操作技巧，但卻也不算簡單。雖然操作上容易很多，對技術的要求也沒有那麼高，但也需要細心和謹慎。不過我還是覺得這次實驗很有趣，因為是以往不太有機會進行的實驗，令我受益良多。
07.09.（二）
資訊來源：
藍忠昱教授上課講義
https://www.sohu.com/a/272515916_172731
Page updated
Google Sites
Report abuse