研究方向

近年研究方向

近年研究領域分六大部份：(1)藻類中微生物菌株分離純化與發酵產物活性物質探討; (2)以發酵槽量產並分離純化不同分子量幾丁聚醣及其抗菌活性與機轉探討; (3)不同分子量幾丁聚醣生理活性及其機轉之研究 (4) 不同分子量幾丁聚醣之免疫調節分析及其相關機轉研究; (5) 利用液相層析串聯質譜儀建立動物用藥多重殘留分析方法開發等研究; (6) 幾丁聚醣及非熱加工處理對果汁中Alicyclobacillus acidoterrestris 殺菌效果及保存之研究。

一、藻類中微生物菌株分離純化與發酵產物活性物質探討

1. 納豆菌發酵海藻及其發酵產品活性探討，主要探討紫菜活性及其納豆菌發酵產品研發與活性探討。澎湖紫菜之甲醇萃取物主要含有catechol，rutin及hesperidin三種多酚化合物，萃取物及此三種多酚化合物均可抑制脂多醣(LPS)所誘導RAW264.7細胞NO之產生，且具劑量依存性，將紫菜之甲醇萃取物更進一步以不同溶劑進行流洗，顯示chloroform流洗液之固醇萃取物主要含有b-sitosterol 與campesterol，由體外乳癌細胞株4T1測試顯示此固醇萃取物可誘導4T1細胞apoptosis。另於4T1乳癌細胞定植之BALB/c mice注射此固醇萃取物(10 and 25 mg/kg body weight)可顯著抑制4T1乳癌細胞生長，延長小鼠存活時間；其可能作用機轉與抑制myeloid-derived suppressor cells (MDSCs)之活性有關。這部份成果已發表於Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (2013)。

2. 後續分離純化紫菜發酵液中納豆激酶，所得酵素比活性為269.44 U/mg，純化倍率5.73倍。其分子量為46.54 kDa，等電點為pI 8.35，Km 值為0.044 mg/mL，Vmax 為9.5 mM/min。納豆激酶最適作用溫度與pH 值，分別為55^oC 及pH 8.0，其於55^oC 保溫1小時仍保有80.33 % 之活性，而於pH 5-9 37^oC 保溫1 小時仍保有89.22 % 以上之酵素活性。10 mM 之Cu²⁺、Fe³⁺ 及2 % 之Triton X-100可提昇酵素活性。此部份成果已發表於Journal of Marine Science and Technology (2015)。

二、以發酵槽量產並分離純化不同分子量幾丁聚醣及其抗菌活性與機轉研究

蝦殼幾丁聚醣製備及其醣類分析，由於目前幾丁聚醣分子量對其抗菌活性影響之相關報告有矛盾，該研究乃以酵素降解、濾膜分子篩分離及甲醇區分技術，製備300–2.2 kDa 六種不同分子量幾丁聚醣，有系統探討四種溫度、三種 pH 值下之抗菌活性。結果我們得到關鍵性的結論：在酸性條件 (pH 5、6) 下，幾丁聚醣抗菌活性隨著分子量增加而增大。在中性 pH 下，分子量大於 30 kDa 幾丁聚醣幾乎不具抗菌活性，分子量小於 (等於) 30 kDa 幾丁聚醣抗菌活性隨分子量增加而下降。此部份成果已發表於Carbohydrate polymers (2015), 此報告發表不到三年，已被引用67次，此成果針對不同分子量幾丁聚醣抗菌能力及實際機制為首例，目前國際期刊尚無直接研究成果。

三、不同分子量幾丁聚醣生理活性及其機轉之研究

蝦殼幾丁聚醣水解物分離純化及其抗氧化、抗致突變活性及機制探討，有系統地探討300–2.2 kDa 六種不同分子量幾丁聚醣之抗氧化及抗致突變能力，結果我們得到關鍵性的結果，各幾丁聚醣之抗氧化及抗致突變活性均隨分子量減少而增強，並得到抗致突變機制主要來自於去致突變性。此部份成果已發表於Carbohydrate polymers (2018)，此成果針對幾丁聚醣抗致突變能力及機制為首例，目前國際期刊尚無其他相關研究成果。

四、不同分子量幾丁聚醣之免疫調節活性及其相關機轉研究

1. 具研究顯示幾丁聚醣與幾丁寡醣具有調節發炎活性。但對於各分子量與抗發炎之間的結果有所矛盾且了解有限。故此研究首先利用發酵槽以酵素水解蝦殼幾丁聚醣分離得到不同聚合度的幾丁寡醣混合物及不同分子量幾丁聚醣，以小鼠 RAW264.7 巨噬細胞株做為研究模式，探討分子量對 RAW264.7 細胞 NO 分泌之影響，並研究各分子量幾丁聚醣調節 NO 分泌可能訊息途徑，進一步了解其抗發炎機制，結果顯示分子量大於 30 kDa幾丁聚醣具抗發炎活性，其中 156 與 72 kDa 幾丁聚醣可與巨噬細胞表面 CR3 受體結合,進而負向調控 MAPK 中 ERK、 JNK 及 p38 訊息蛋白，抑制 NF-κB 轉錄活性，降低 iNOS 蛋白表現量，抑制由 LPS 誘導 RAW264.7 產生過量的 TNF-α 及 IL-6，來達到抗發炎的效果。分子量 ≦ 29.2 kDa 之幾丁聚醣具促發炎活性。7.1 kDa幾丁聚醣可與巨噬細胞表面CD14、TLR4 及CR3 等受體結合，進而活化 MAPK中 JNK 訊息蛋白，活化NF-κB 轉錄活性，增加iNOS蛋白表現量，進而增加NO分泌量。此部份成果已發表於International Journal of Biological Macromolecules (2019)。

2. 以動物餵食試驗模式評估不同分子量幾丁聚醣水解產物之免疫活性，幾丁聚醣水解產物對雌性 BALB/c 小鼠的免疫調節活性，以三種不同劑量幾丁聚醣水解液（50 mg、500 mg 和2.5 g/kg體重）餵食小鼠四週，餵食500 mg/kg 劑量的幾丁聚醣水解液可顯著增加腹腔巨噬細胞的吞噬能力、提升由concanavalin A (ConA)所刺激的脾臟淋巴細胞增生與血中IgM 抗體含量。進一步以500 mg/kg 的劑量餵食小鼠各幾丁聚醣樣品探討其對小鼠非特異性免疫活性的影響，結果顯示幾丁聚醣水解液與oligomixture 明顯提升腹腔巨噬細胞的吞噬活性，各幾丁聚醣樣品均可增加由ConA 所刺激的脾臟與培耶氏斑淋巴細胞增生活性，亦會明顯提升lipopolysaccharide (LPS) 所刺激的脾臟淋巴細胞增生活性，此外，分子量低於 30 kDa幾丁聚醣可明顯增加由LPS所刺激的培耶氏斑淋巴細胞增生。攝食分子量低於 30 kDa幾丁聚醣或oligomixture均可顯著增加血中IgG 與IgM 抗體含量，與刺激脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ，並誘導經裂殖素刺激的脾臟淋巴細胞分泌Th1 細胞激素為主的免疫反應。在特異性免疫反應方面，顯示分子量低於 30 kDa幾丁聚醣 與oligomixture可分別提升由OVA 所刺激的脾臟與培耶氏斑淋巴細胞增生活性，oligomixture 更可顯著增加血中OVA 特異性抗體IgM、IgG 與IgA 含量，較低分子量幾丁聚醣組別明顯降低血中OVA 特異性抗體IgG1 含量，而oligomixture則增加特異性IgG2b 抗體含量，此外，各幾丁聚醣樣品均顯著增加IFN-γ/IL-4 (Th1/Th2)比例，結果顯示幾丁聚醣可刺激小鼠脾臟淋巴細胞產生以Th1 為主的免疫反應。此部份成果已發表於International Journal of Biological Macromolecules (2019)。

五、利用液相層析串聯質譜儀建立動物用藥之多重殘留分析方法開發研究

抗原蟲類藥物可被應用於畜禽水產品，以預防或治療原蟲感染之疾病，達到經濟效益。惟若業者不當使用、停藥期管控不良或者飼料間交叉污染，可能造成食用動物組織內藥物殘留，影響消費者健康。本研究針對八種不同基質(豬肉、雞肉、牛肉、魚肉、豬肝、豬腎、雞蛋及牛乳)建立21項抗原蟲用藥及1項抗菌劑之檢驗方法。實驗初期比較四種萃取條件，後端利用串聯質譜儀配合多重反應模式進行分析。結果顯示，其餘19項動物用藥皆可達到良好定量及定性效果。本研究考量殘留標準之分布範圍，選擇四個添加濃度(0.0005、0.001、0.002及0.005 ppm)，在添加回收試驗之結果均符合衛生福利部食品藥物管理署食品化學檢驗方法確效規範，且大部分藥物之定量極限為0.5~2.5 ng/g。此研究方法快速、靈敏，此成果已發表於Journal of Food and Drug Analysis (2019)。

六、幾丁聚醣及非熱加工處理對果汁中Alicyclobacillus acidoterrestris 殺菌效果及保存之研究

A. acidoterrestris 所產之內孢子可在包裝果汁經巴斯德滅菌處理後而萌發生長，將會於環境中利用酚類物質代謝產生Guaiacol風味，如藥味、消毒水味等不好的風味從產品外觀上並未能發覺產品已腐敗，直至造成企業因客訴案件後才知道本身的產品已腐敗，對商譽、產品品質、成本之影響無法估計，綜觀當前以提高商業殺菌條件便可將其孢子殺滅，同時也會使得產品之官能、營養成份品質下降，且提高能源的成本增加，特別是針對能源受限國家。若能建立以非熱式殺菌技術之開發為當今現況所需。 本計畫第一年，將分別利用三種有機酸以及不同分子量幾丁聚醣樣品於不同溫度下評估對A. acidoterrestris之菌體以及孢子之影響，最終建立取得最適抑制菌株生長參數，包含 (1) 不同溫度、(2) 有機酸種類、(3) 不同分子量幾丁聚醣，最終將所得參數利用三種不同果肉含量之濃縮還原果汁，並人為添加測試菌株之三種果汁進行儲存試驗，以建立於模擬果汁儲存模型參數。計畫第二年，利用非熱加工處理技術，高壓處理對測試菌株之生長影響，初步將先針對測試菌株經加熱前或後，再進行不同壓力之高壓處理評估其菌體及孢子之影響，取得最適高壓處理之壓力、處理時間、處理溫度等。後續進行人為添加測試菌株於以有機酸、幾丁聚醣樣品之果汁樣品經高壓處理後於不同溫度下之儲存試驗。其中分別間隔時間採樣分析測試菌株菌量，並觀察其菌體、孢子經處理後之型態變化，以及分析儲存過程中所產生藥味等之不良氣味 (Guaiacol)，以了解其可能抑制機轉。