Déroulement

Pour commencer, afin que la donneuse produise un nombre d’ovocytes supérieur à la normale, le vétérinaire lui administre un traitement de superovulation.

Ce traitement doit être injecté matin et soir pendant 4 jours, 10 jours après les chaleurs. Pour compléter ce traitement, on administre à la donneuse une injection de prostaglandine F2alpha pour induire ses chaleurs et permettre son insémination.

En Belgique, il existe deux traitements de superovulation autorisés : le Stimufol® et le Pluset®. Ces traitements sont tous deux à base des hormones FSH et LH.

Ensuite, la donneuse est inséminée. Généralement, on effectue 2 ou 3 inséminations à 12 heures d’intervalle pour multiplier les chances de fécondation de tous les ovocytes.

Après 7 jours, lorsque les embryons sont au stade morula ou blastocyste, le vétérinaire récolteur procède à la récolte des embryons. Il commence par une injection épidurale sur la donneuse.

Le vétérinaire insère ensuite la sonde de récolte dans le vagin de la donneuse jusqu’à la corne utérine qu’il souhaite récolter (il doit toujours récolter les deux cornes). Il gonfle le ballonnet de la sonde pour boucher l’entrée de la corne et commence à injecter des doses croissantes de liquide de récolte, du PBS (Phosphate Buffered Saline), pour récupérer les embryons qui s'y trouvent.

La sonde de récolte

Il existe 2 types de sondes : 

La sonde à deux voies contient une voie pour gonfler le ballonnet et une pour injecter et récupérer le liquide de récolte.

La sonde à trois voies possède une voie pour le ballonnet, une pour injecter le liquide de récolte, et une dernière pour le récupérer.

La sonde à deux voies est davantage utilisée, car plus pratique.

Les embryons récoltés sont ensuite examinés au moyen d’une loupe binoculaire.

Le vétérinaire les répartit en 5 classes :

• classe 1 (excellent) : l’embryon présente un développement normal ainsi qu’un aspect symétrique et forme une masse compacte ;

• classe 2 (bon) : l’embryon présente un aspect asymétrique et éventuellement un retard de développement, il forme une masse compacte, mais certaines cellules s’en séparent ;

• classe 3 (moyen) : l’embryon présente un retard de développement, des vésicules et son aspect est plus sombre ou plus clair que la normale ;

• classe 4 (mauvais) : l’embryon présente un retard de développement important et ne forme pas une masse compacte ;

• classe 5 : l’embryon est dégénéré.

Idéalement, seuls les embryons de classe 1, 2 et éventuellement 3 font l’objet d’un transfert.

Même s’ils ne seront pas transférés, les embryons de classe 4 et 5 sont conservés pour subir un contrôle sanitaire.

Les embryons qui seront transférés doivent ensuite être immergés dans 10 bains d’éthylène glycol, un agent cryoprotecteur qui empêche leur cristallisation lors de leur congélation.

Les embryons destinés à l’exportation doivent passer dans un bain supplémentaire constitué de trypsine qui permet d’éliminer les potentiels virus situés en périphérie de la zone pellucide.

Les embryons sont mis en paillette manuellement. On ne place qu’un seul embryon par paillette.

Les embryons à congeler sont conditionnés dans des paillettes jaunes, alors que ceux à transférer en frais sont conditionnés dans des paillettes transparentes.

Une paillette contient du milieu de vie (OCM, ovum culture medium) et, dans le cas où l'embryon est destiné à être congelé, de l’éthylène glycol. Ces différents composants ne sont pas mélangés dans la paillette, mais séparés par une bulle d’air. Ils sont disposés dans l’ordre suivant :

OCM — air — éthylène glycol — air – éthylène glycol + embryon — air — éthylène glycol – OCM.

Cette étape est facultative, les embryons peuvent être transférés directement si une receveuse était en chaleur 7 jours auparavant.

Les embryons sont congelés au moyen d’un congélateur à embryon, un dispositif portatif.

La congélation des embryons suit une courbe de congélation : la température de la paillette descend à -7 °C à une vitesse de 1 à 3 °C par minute. Elle est maintenue à cette température pendant 5 à 7 minutes avant de procéder au seeding, puis sa température descend à -35 °C à une vitesse de 0,3 à 0,6 °C par minute. Finalement, la paillette est placée dans une cuve remplie d'azote liquide à -196 °C.

La congélation des embryons permet une conservation à plus long terme et il n’est alors pas nécessaire de synchroniser les chaleurs de la donneuse et des receveuses.

Des embryons congelés peuvent être conservés pour une durée indéterminée s’ils sont maintenus dans une cuve d’azote liquide.

Pour décongeler un embryon, la paillette est retirée de l’azote liquide et placée dans de l’eau comprise entre 22 et 25 °C pendant une trentaine de secondes.

Cette technique de décongélation des embryons, aussi appelée décongélation rapide, se distingue d’une méthode plus ancienne appelée décongélation « lente ». Autrefois, l’utilisation de glycérol à 10 % nécessitait d’éliminer progressivement ce cryoprotecteur en plongeant l'embryon dans quatre bains de sucrose avant de procéder au transfert.

⬆️ Épidurale

Initialement, les transferts d’embryons étaient réalisés par voie chirurgicale au niveau du flanc, du côté de l’ovaire porteur du corps jaune. À l’heure actuelle, ils sont réalisés par voie transcervicale au moyen d'un pistolet de transfert.

Avant de procéder au transfert d’embryon, le vétérinaire transféreur administre une injection épidurale à la receveuse, ce qui permet d’assouplir les organes de la femelle.

La paillette est placée dans le pistolet de transfert, une gaine à usage unique est insérée sur le pistolet et l’ensemble est recouvert d’une chemise sanitaire. Le vétérinaire insère le pistolet dans le vagin de la femelle, il perfore la chemise sanitaire au moment de passer le col de l’utérus, puis dépose l'embryon dans la corne utérine de l’ovaire où a eu lieu l’ovulation.

Le prélèvement d’ovocyte peut être réalisé sur la donneuse vivante par voie transvaginale au moyen d’une sonde de ponction échoguidée, ou sur les ovaires de la donneuse récupérés en abattoir par aspiration du liquide folliculaire ou par dissection de l’ovaire.

L'ovum pick up peut avoir lieu à n’importe quel moment du cycle de la femelle. Il peut également être réalisé sur des veaux à partir de 6 mois ainsi que sur des femelles gestantes jusqu’à trois mois.

Une fois prélevés, les ovocytes doivent atteindre leur maturation dans un milieu spécifique. Ce processus dure environ 24 heures. Ils sont ensuite aptes à être fécondés.

Lorsque les ovocytes ont atteint leur maturité, les spermatozoïdes sont introduits dans la boîte de culture pour les féconder. La fécondation in vitro dure environ 18 heures, elle est appelée « ON » (over night), car les ovocytes et les spermatozoïdes restent généralement une nuit entière dans la boîte de culture.