微生物學實驗

藍忠昱老師

藍忠昱

依舊是一個很電ㄉ老師~

清華特聘教授

信箱：cylan@life.nthu.edu.tw

辦公室：生科一館405室

辦公室電話：03-5742473

實驗室分機：03-5715131 #33468

學歷：美國加州大學戴維斯分校博士

領域：分子生物學、分子微生物學

上課內容

課程簡介：

微生物是一群奇妙的生物，雖然我們看不見這些小傢伙，但牠們其實就生活在我們身邊，也會對我們的身體與生活造成許多影響。透過這堂課，我們學到了許多關於微生物的知識，除了更了解這些微生物，也可以知道牠們可以如何在生活中應用。

課程內容：

微生物的定義~~什麼是微生物？難以用肉眼直接看到的微小生物~~

五大類微生物：細菌、原生動物、藻類、病毒、真菌(酵母菌、黴菌)

細菌

原生動物

藻類

病毒

酵母菌

黴菌

奇妙的微生物們

太古生物

在洞窟中發現

長度約為0.2µm

大約是E. coli 的1/150

是超級小的細菌

Ca. Thiomargarita namibiensis

在納米比亞的海岸發現

長度約100~750µm

已經算是很大的細菌了

Ca. Thiomargarita magnifica

華麗硫珠菌

在加勒比海的紅樹林發現

長度最長可以到2公分

是一種巨型細菌

細胞結構

根據細胞的細胞核結構可以分為原核細胞(Prokaryotic)和真核細胞(Eukaryotic)

http://www.life.umd.edu/classroom/bsci424/ BSC I223 WebSiteFiles/ ProkaryoticvsEukaryotic.html

原核生物

有細胞壁、細胞膜與外膜

流體之細胞質

其他外在之結構，例如:鞭毛flagella

•細胞質：大多數細菌代謝反應發生之場所

• Cytosol：細胞質之液體成份

• Nucleoid：chromosome (染色體) 之所在,不具有核膜

• Plasmids (質體)：small, closed circular DNA

• Ribosomes (核醣體)：蛋白質之合成

•flagella (鞭毛)：細菌的運動器官,使細菌能在液體環境中泳動

細菌的細胞壁

•細菌的細胞壁是由肽聚糖(Peptidoglycan)的多元體所組成

• 肽聚糖單元體：

N-acetyl glucosamine (NAG)

N-acetyl muramic acid (NAM)

pentapeptide

• 肽聚糖多元體：由成鏈相同的肽聚糖單元體組成

細菌的細胞膜

•細胞膜主要的化學組成是磷脂質(phospholipid) 與蛋白質(proteins)

• 主要之功能:

(1)選擇性之通透膜：決定物質之進出 (例如:營養素、氣體)

(2)排出廢物、形成胞子

(3)抗生素的作用目標 (例如：polymyxins)

http://student.ccbcmd.edu/~gkaiser/goshp.html

革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌

革蘭氏陽性菌

在革蘭氏染色中呈現紫色

革蘭氏陽性細菌：

Staphylococcus aureus(金黃葡萄球菌)

Clostridium tetani (破傷風菌)

革蘭氏陽性菌的細胞壁

成分：肽聚醣(60%~80%)，防止細胞因滲透壓造成溶菌

磷壁酸，增強細胞壁之強度，協助調節離子通過粘液層

脂壁酸，充當自溶壁酶（胞壁酸酶）的調節劑

蛋白質，形成酵素、黏附素、侵染素、抵抗吞噬細胞攻擊

革蘭氏陰性菌

在革蘭氏染色中呈現紅色

革蘭氏陰性菌：

Escherichia coli (大腸桿菌)

Pseudomomas aeruginosa(綠膿桿菌)

革蘭氏陰性菌的細胞壁

成分：肽聚醣(10%~20%)，防止細胞因滲透壓造成溶菌

外膜(磷脂質、脂蛋白、脂多醣、蛋白質)

脂多醣(LPS)是內毒素,可促進免疫反應

蛋白質會形成酵素、黏附素、侵染素、抵抗吞噬細胞攻擊

微生物疾病的發生

影響因子：環境因素、微生物致病力、寄主之抵抗力與敏感性

微生物的致病因子：

1.病原菌之附著力(adhension):莢膜、表面多醣物、附著性表面蛋白及菌絲等

2.穿透(entry):產生破壞組織或細胞的物質,如:蛋白酶、脂酶等

3.侵入(invasion)與增殖(multiplication)

4.毒素:外毒素—包括神經毒素、細胞毒素、腸毒素

內毒素—如革蘭氏陰性細菌外膜之LPS

微生物的利用

醫療方面：

抗生素、疫苗、檢驗試劑

食物方面：

釀造酒與醬油、發酵食品、香料色素、保健食品

化工方面：

生物轉化、製造有機酸、胺基酸、工業用酵素

農業方面：

植物的固氮菌、殺蟲劑、除草劑、製造肥料

環保與能源方面：

生物分解、處理汙泥與廢水、一種生質能源

抗生素(盤尼西林為例)

佛萊明在1929年偶然發現青黴菌可以抑制葡萄球菌生長

紅色酵母菌(Xanthophyllomyces dendrorhous)

有蝦紅素(一種天然色素，為脂溶性分子,屬於類胡蘿蔔素的一種，也是抗氧化劑)

對健康可能有益 (預防新血管疾病、免疫缺陷等)

實驗部分

細菌培養

劃線法

streak-plate method

1.將接種環在酒精燈上燒紅後冷卻

2.接種環沾取單一菌落，以鋸齒狀畫在培養基上

3.重複 (1) 和 (2) 三次

4.將培養皿倒置於37°C培養箱中培養16小時

5.觀察結果

塗抹法

spread-plate method

1.取稀釋菌液0.1ml加在培養基表面

2.取出泡在95%酒精中的三角玻璃棒，過火，冷卻

3.用三角玻璃棒將菌液均勻塗抹在培養基上

4.三角玻璃棒過火，確認沒有火後放回95%酒精中浸泡

5.將培養皿倒置於37°C培養箱中培養16小時

6.觀察結果

液體培養

broth method

1.使用p200的pipetman接tip，沾取單一菌落

2.tip尖端伸入離心管的培養液中，輕輕攪拌並pipeting

3.將tip退到離心管中

4.將培養液置於37°C培養箱中震盪培養16小時

5.觀察結果

實驗結果

在劃線法和塗抹法中都出現了大腸桿菌以外的菌落，大腸桿菌的菌落較小，但培養皿中出現了非常多巨型菌落，應該是因為沒有在無菌環境下操作實驗，導致培養皿遭到其他細菌汙染。

在液體培養中，可以很明顯看出有加入菌並讓它生長的離心管比沒有加入細菌的離心管混濁，但不知道液體培養的細菌是否也有被汙染。

細菌實驗~~照射UV

實驗步驟

1.用塗抹法做出三塊沾有細菌的培養皿

2.將塗好菌的培養皿打開蓋子並置於陽光下

3.讓培養皿分別遭受陽光的照射0分鐘、5分鐘、20分鐘

4.將培養皿倒置於37°C培養箱中培養

5.觀察細菌生長情形

無照射

照射5分鐘

照射20分鐘

實驗結果

沒有經過陽光照射的培養皿細菌明顯比有經過照射得多，但照射5分鐘與照射20分鐘的菌落數則沒有明顯的差距

(照射5分鐘菌落數：21 ，照射20分鐘菌落數18)

細菌實驗--抑菌

實驗步驟

1.用簽字筆在培養皿底部分出五塊空間，並在五個空間標示藥品(無菌水、漂白水、酒精、蒜頭萃取液、AMP)

2.將0.1ml的大腸桿菌用塗抹法塗抹在培養皿上

3.將鑷子過火，夾取AMP濾紙貼上培養基，然後在過火一次

4.用鑷子在夾四片圓形濾紙貼上培養基

5.分別滴10µl的無菌水、漂白水、酒精、蒜頭萃取液到圓形空白濾紙上

6.將培養皿正放，置於37°C培養箱中隔夜培養

7.觀察抗生素、萃取液、化學藥劑抑制細菌生長的情形

劃線法

塗抹法

長菌的培養液 VS 原來的培養液

細菌染色

Simple staining(正染色法)

利用一種染劑，目的是觀察菌體型態

使用Crystal violet 結晶紫，染劑帶正電

實驗步驟

1.取5µl的無菌水滴在載玻片上

2.用tip沾少量菌體到玻片上的水中

3.用鑷子夾著載玻片來回通過於酒精燈上，直到水分蒸乾

4.用滴管滴一滴結晶紫染劑到乾掉的細菌上，等待60秒

5.用二次水輕輕將染劑沖洗掉

6.加上蓋玻片，並用顯微鏡觀察

Negative staining(負染色法)

酸性染色，染劑因帶負電而無法進入菌體

菌體透明造成對比

染劑使用苯胺黑 Nigrosin

實驗步驟

1.滴一滴苯胺黑染劑在載玻片邊邊

2.用tip沾少量菌體到玻片上的染劑中

3.用另外一片蓋玻片將混有細菌的染劑推平

4.蓋上大塊的蓋玻片，到顯微鏡下觀察

Gram staining(革蘭氏染色法)

由一位丹麥醫生於1884年發明

利用細菌細胞壁構成成分不同，可初步鑑別細菌

革蘭氏陽性菌細胞壁的肽聚醣層厚，染劑保留在菌體內，呈紫色

革蘭氏陰性菌細胞壁的肽聚醣層薄，染劑不易保留，呈現紅色

實驗步驟

1.分別滴三滴5µl的水在載玻片的左邊、中間、右邊

2.分別用tip將大腸桿菌、大腸桿菌+枯草桿菌、枯草桿菌加入到玻片上的水中

3.用鑷子夾著載玻片來回通過於酒精燈上，直到水分蒸乾

4.各滴一滴結晶紫染劑到乾掉的細菌上，等待10秒

5.用二次水輕輕將染劑沖洗掉

6.各滴一滴碘液到細菌上，等待10秒

7.用二次水輕輕將染劑沖洗掉

8.各滴一滴95%酒精到細菌上，等待10秒

9.用二次水輕輕將染劑沖洗掉

10.各滴一滴番紅染劑到細菌上，等待10秒

11.用二次水輕輕將染劑沖洗掉

12.加上蓋玻片，到顯微鏡下觀察

Escherichia coli

革蘭氏陰(紅色)

E. coli + B. subtilis

兩者皆展現

Bacillus subtilis

革蘭氏陽(紫色)

心得

在這次的微生物課程中，我學到了好多與微生物相關的有趣知識，他們可以到非常小，也可以大到用肉眼即可觀察。不僅讓我更加認識這些小生物，也讓我感受到自然界的千變萬化。課堂中我們做了培養細菌的實驗，但養出來的細菌都被其他種類的細菌汙染，看來做細菌相關的實驗真的非常需要在無菌環境下操作。我們也做了許多種細菌染色實驗，使細菌更容易被觀察。總之這堂課帶給我許多新知識與新技能，收穫很豐富。

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