Analisi tramite real-time PCR dell'espressione genica in tessuti di topo
Protocolli
Giorno 1: Estrazione di RNA e DNA a partire da muscolo e fegato murini
Estrazione dell’ RNA
Omogenizzazione dei campioni e separazione di fase
Isolamento dell’RNA: precipitazione, lavaggio e risospensione
Isolamento del DNA: precipitazione, lavaggio e risospensione
Giorno 1: Estrazione di RNA e DNA a partire da muscolo e fegato murini
Estrazione dell’RNA
Per una corretta riuscita dell’estrazione dell’RNA, occorre prestare alcune piccole attenzione affinché il materiale estratto non si degradi.
L’RNA è un acido nucleico relativamente stabile; tuttavia gli enzimi che lo degradano sono particolarmente abbondanti nella pelle e nella saliva, dove hanno una funzione principalmente di difesa.
Per questo motivo durante l’estrazione sarà necessario indossare i guanti (come durante tutta l’esperienza di laboratorio ) e bisognerà prestare attenzione a non parlare nel momento in cui i tubini contenenti l’RNA sono aperti.
Inoltre, al fine di minimizzare la degradazione del materiale, tutta la procedura verrà effettuata mediante l’utilizzo di puntali con filtro RNAsi/DNAsi free, nonché la risospensione del materiale avverrà in acqua RNAsi/DNAsi free.
Si suggerisce di posizionare le eppendorf nella centrifuga prestando attenzione che la cerniera sia rivolta verso l’esterno; ciò facilita l’individuazione del pellet e evita la perdita di acidi nucleici durante la rimozione del surnatante.
Omogenizzazione dei campioni e separazione di fase
- Siglare preventivamente tutte le provette;
- Polverizzare i tessuti in azoto liquido mediante pestello e mortaio preraffreddati con azoto liquido (è consigliabile cominciare con il fegato in quanto più semplice da polverizzare; tra un tessuto e l’altro pulire il mortaio con della carta );
- Una volta polverizzato il tessuto, trasferire con l’aiuto di una spatolina la polvere in una eppendorf contenente 500 µl di Trizol e riporre il tutto in ghiaccio;
- Vortexare brevemente i campioni;
- Incubare i campioni per 5 minuti a temperatura ambiente;
- Aggiungere 100 µl di cloroformio in ogni campione e chiudere i tubini;
- Agitare vigorosamente a mano i campioni per 15 secondi; - Incubare 3 minuti a temperatura ambiente;
- Centrifugare a 12000 g per 15 minuti a 4°C ( in questo passaggio avverrà la separazione delle fasi );
- Prelevare la fase acquosa contenente l’RNA evitando di prelevare fase organica e/o interfase e trasferirla in un nuovo tubo preventivamente siglato;
- Conservare in ghiaccio la rimanente fase organica contente il DNA genomico e interfase che serviranno per estrarre il DNA;
Isolamento dell’RNA: precipitazione, lavaggio e risospensione
- Aggiungere 250 µl di isopropanolo al tubino con la fase acquosa;
- Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti;
- Centrifugare a 12000 g per 10 minuti a 4°C in modo da precipitare l’RNA;
- Rimuovere il surnatante invertendo delicatamente il tubino, in modo da non staccare il pellet;
- Lavare il pellet con 500 µl di etanolo 75%;
- Vortexare brevemente o in alternativa picchiettare vigorosamente il tubino per staccare il pellet;
- Centrifugare a 12000 g per 5 minuti a 4°C in modo da consentire al pellet di aderire nuovamente al fondo della eppendorf;
- Rimuovere accuratamente l’etanolo utilizzato per il lavaggio con la pipetta, cercando di eliminare quando più surnatante possibile facendo comunque attenzione a non staccare il pellet;
- Lasciare i tubini aperti ad asciugare all’aria per 10 minuti o fintanto che il pellet risulta quasi completamente asciutto;
- Risospende l’RNA in acqua RNAsi/DNAsi free, in un volume di circa 200 - 250 µl ( il volume di risospensione va aggiustato in base alla dimensione del pellet).
Isolamento del DNA: precipitazione, lavaggio e risospensione
Il DNA viene isolato a partire dalla fase organica e interfase conservate dalla separazione di fase e prelievo della fase acquosa.
- Rimuovere il più possibile eventuali rimanenze di fase acquosa senza curarsi di eventuali piccoli prelievi di interfase e/o fase organica;
- Aggiungere 150 µl di etanolo assoluto;
- Chiudere il tubino e invertire i campioni diverse volte per mescolare la soluzione;
- Incubare 3 minuti a temperatura ambiente;
- Centrifugare a 2000 g per 5 minuti a 4°C per pellettare il DNA;
- Rimuovere e scartare il surnatante ( fase organica + etanolo );
- Lavare il pellet di DNA con 500 µl di soluzione di sodio citrato in etanolo (100 mM sodio acetato in 10% etanolo, pH 8.5 );
- Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, mescolando occasionalmente per inversione;
- Centrifugare a 10000 g per 5 minuti a 4°C;
- Rimuovere il surnatante mediante l’utilizzo della pipetta;
- Lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo 75%;
- Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente mescolando occasionalmente i campioni per inversione;
- Centrifugare a 10000 g per 5 minuti a 4°C in modo da consentire al pellet di aderire nuovamente al fondo della eppendorf;
- Rimuovere il surnatante con la pipette;
- Lasciare i tubini aperti ad asciugare all’aria per 10 minuti o fintanto che il pellet risulta quasi completamente asciutto;
- Risospendere il DNA in 300 - 500 µl di acqua RNAsi/DNAsi free pipettando per favorire la risospensione;
- Opzionale: per rimuovere il materiale insolubile, centrifugare a 12000g per 10 minuti a 4°C;
- Trasferire il surnatante, contenente il DNA in un nuovo tubino.
Giorno 2: Quantificazione dell’RNA, sintesi del cDNA e gel elettroforesi dell’RNA estratto
Quantificazione dell’RNA mediante Qubit
- Scongelare l’RNA in ghiaccio;
- Per ogni campione allestire la seguente reazione:
Volume
Qubit RNA BR buffer 198 µl
Qubit RNA BR dye 1 µl
RNA estratto 1 µl
Volume finale 200 µl
- Vortexare brevemente e spinnare;
- Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente al buio;
- Effettuare la lettura al fluorimetro Qubit
Preparazione del gel di agarosio
- Preparare il tampone di corsa TAE 1X a partire da uno stock TAE 50X;
- Predisporre le vaschette per la colata del gel;
- Preparare un gel di agarosio al 1% peso/volume utilizzando come solvente il tampone di corsa in una beuta;
- Scaldare al microonde la soluzione evitando l’ebollizione fino al momento in cui l’agarosio è completamente fuso (in controluce non si notano più i cristalli di agarosio);
- Sotto cappa chimica, aggiungere alla beuta con l’agarosio il SYBR safe utilizzando uno stock 10000X;
- Colare il gel all’interno delle vaschettine predisposte evitando di fare bolle d’aria;
- Aspettare che il gel solidifichi
Corsa elettroforetica dell’RNA totale
- Preparare i campioni da caricare all’interno di un tubino da 0.2 ml come segue:
Volume
RNA totale X µl per avere 1 µg di RNA totale
Loadying Dye 6X Z µl per avere 1 X
Acqua RNAsi/DNAsi free Y µl per ottenere 20 µl
Volume finale 20 + Z µl
- Caricare i campioni in gel segnando l’ordine di caricamento;
- Caricare il marcatore di peso molecolare
Sintesi del cDNA
- Per ogni campione, combinare in un tubino da PCR le seguenti componenti:
Volume
RNA totale sperimentale 400 ng = X µl
Random esameri ( 0.5 µg/reazione ) 1 µl
Acqua RNAsi/DNAsi free Y µl per arrivare a 10.7 µl
Volume finale 11.7 µl
- Spinnare i tubini in una minicentrifuga da bancone;
- Incubare per 5 minuti a 70°C;
- Rimuovere i tubini dal termoblocco e raffreddare in ghiaccio per almeno 5 minuti;
- Preparare per ogni campione la seguente mix di retrotrascrizione (prepareremo una mix totale per i campioni con un eccesso di 0.5 per garantire volume a sufficienza per tutti i campioni):
Volume
Buffer di reazione GoScript 5X 4.0 µl
MgCl2 25 mM 2.0 µl
PCR Nucleotide Mix 1.0 µl
Recombinant RNasin 0.3 µl
GoScript Reverse Transcriptase 1.0 µl
Volume finale 8.3 µl
N.B. Essendo Recombinant RNasin e GoScript Reverse Transcriptase conservati a -20°C per garantirne la stabilità (non sono congelati in quanto sono conservati in glicerolo ) ed essendo i volumi piccoli verranno inseriti nella mix dagli esercitatori.
- Aggiungere ad ogni campione conservato in ghiaccio 8.3 µl di mix di retrotrascrizione;
- Mescolare vigorosamente pipettando;
- Spinnare i tubini;
- Incubare tutti i campioni in termociclatore con il seguente programma:
Step Temperatura Tempo
Annealing 25°C 5 minuti
Retrotrascrizione 42°C 60 minuti
Inattivazione RT 70°C 15 minuti
- Diluire il cDNA ottenuto aggiungendo 30 µl di acqua RNAsi/DNAsi free (gruppi pari) o 80 µl di acqua RNAsi/DNAsi free (gruppi dispari);
- Conservare il cDNA ottenuto a -20°C