Эволюция генной Взаимодействия
Дэвид А. Гарфилд и Григорий А. Рей
Дэвид А. Гарфилд (dag23 @ герцога.EDU) И Григорий А. Рей (gwray @ Дух.EDU) Являются с кафедрой биологии и Институт генома науки и политики в Университете Дьюка, в Дарем, Северная Каролина.
Изменения в сроках и уровня, при котором гены выражены, как известно, играют важную роль в эволюции, но механизмы, определяющие изменения в экспрессии генов, остается сравнительно малоизвестной. До недавнего времени эволюционных биологов, как и большинство биологов, как правило, для изучения одного гена изолированных лиц. Эти исследования имеют огромное добавил к нашему пониманию биологической эволюции. Но из-за генной регуляции, по самой своей природе предполагает взаимодействие между двумя (или более) генов, исследователи пропустили ряд эволюционных явлений, которые можно наблюдать только на уровне сетей взаимодействующих генов. В этой статье мы рассмотрим изменения в перспективе, что геномные технологии, особенно появление крупной платформы для секвенирования ДНК генотипирование и измерения экспрессии генов-с целью передачи в эволюционной биологии. Мы конкретно о том, как эти технологии могут и в настоящее время используется для увеличения нашего понимания, как и почему экспрессии генов эволюционирует.
Ключевые слова: эволюция, генных сетей, геномика, экспрессию генов, регуляции генов
ТОн идея, что изменения в регуляции генов может играть важную роль в эволюции не является новой. В статье, опубликованной влиятельным в 1975 году, Мэри-Клэр Кинг и Аллан Уилсон утверждал, что из-за последовательности и функции белков, выделенных из людей и шимпанзе были настолько похожи, что-то другое, чем эволюция белков таковые должны лежать в основе фенотипические различия между этими двумя видами. Они положено, что изменения в экспрессии генов были ответственны за более адаптивной эволюции, чем изменения в белок-кодирующих областей генов. Король и гипотезы Вильсона была оформлена без ссылки на конкретные молекулярные механизмы. Однако существует все больше доказательств из области развития генетики поддержку гипотезы, что "малые различия в момент активации или в уровне активности [даже] одного гена" может иметь важные последствия эволюционного в связи с обширным последствиям, что изменения В нормативно взаимодействие может оказать на процессы развития и, таким образом, организменном формы и функции.
В 1983 году Рудольф Рафф и Томас Кауфман толкнул важность изменения в регуляции генов для эволюции дальнейшего их книги Эмбрионы, гены и эволюция. Рисунок из сотни исследований в области развития генетики, эмбриологии и эволюционной биологии, Рафф и Кауфман предположил, что мутации, затрагивающие функции генов, вероятно, лежат в основе многих эволюционные изменения в морфологии. Их рассуждения были основаны на двух наблюдениях о биологических системах. Во-первых, целевые возмущения биологических системах часто приводит к крупномасштабной скоординированной изменений в организменном фенотипа. Ярким примером этого являются координация homeotic мутации, такие, как те, которые затрагивают функции фактора транскрипции UBX или сайты связывания ДНК. Мутации в одном из этих генов приводит к трансформации тела одного сегмента в другой (Гилберт 2006). Эти мутации являются наглядными примерами того, как изменения всего за несколько нормативных взаимодействие может привести к крупномасштабной морфологических изменений.
Их вторая наблюдения является то, что влияние изменений в регуляторных генов или их целевой ДНК могут быть "настроен", влияет только на конкретной ткани. Для ферментов и структурных белков, последовательности аминокислот непосредственное диктует функции, определяющие, например, каталитическими свойствами и субстратной специфичности ферментов. Изменения в аминокислотной последовательности таким образом, непосредственно влияет на функцию белка, и делает это, при прочих равных условиях, во всех тканях, в котором выразил ген. Воздействие нормативного мутаций, с другой стороны, косвенные, затрагивающие фенотипа через деятельность и выражение генов, которые они регулируют. Например, нормативно мутация может измениться, когда и где в разработку миграцию клеток или распространение начинается, изменяя тем самым взрослой морфологии, не затрагивая основных клеточных процессах. Изменения в белок-кодирующих последовательностей генов необходимы основные функции, такие, как деление клетки или распространения, напротив, весьма плейотропный, эти изменения влияют на все случаи деления клеток, часто с драматическими и пагубные последствия. Таким образом, Рафф и Кауфман утверждал, хотя мутации происходят во всех генах, мутации затрагивающие нормативно взаимодействий меньше шансов быть пагубными, чем изменения в необходимый белок-кодирующих генов.
Гипотез короля и Уилсон и Рафф и Кауфман вместе указывает на потенциальное значение нормативного взаимодействия в эволюционных изменений. Поступая таким образом, они направляли внимание от одного гена и к сети взаимодействующих генов. Хотя эти идеи как потом оказалось на удивление дальновидным, в то время они были концептуальные споры с четкой поддержкой нескольких примерах. На протяжении многих лет одним из основных препятствий мешающих прогрессу в изучении эволюции генных сетей: легче выявить ген, чем взаимодействия генов, а гораздо проще определить изменения в последовательности гена, кодирующего, чем изменения в регуляции генов. В результате, мы знаем гораздо больше о том, как отдельные гены и белки развиваться, чем мы о том, как взаимодействие между генами эволюционировать, и еще меньше о последствиях изменений в нормативно взаимодействий на организменном фитнесу. Пробел в наших знаниях была огромная течение 1980-х, но с тех пор сократился с введением нескольких методов.
The Hox Парадокс
Внедрение полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы визуализации местоположения белка и мРНК в течение целых клеток и эмбрионов в 1980 дала возможность наблюдать, когда и где в эмбрион конкретные гены и была выражена их белковых продуктов, и соблюдать что случилось с этими структурами выражения, когда другие гены были экспериментально изменен. Оно также стало возможным сравнение моделей экспрессии генов между различными видами, а в 1990-х годов сотни исследований были опубликованы сравнивая выражение одного и того же гена в эмбрионах различных видов.
Из этих исследований пришли некоторые важные результаты, подтверждающие значение изменений в нормативно взаимодействия генов в эволюции. Первое было осознание того, что даже животные с очень разными теле планах есть общий набор регуляторов в области развития взаимодействия которого поразительно сохраняется. Ключевым открытием было то, что Hox гены, которые, как известно, играют ключевую роль в структурирование основной оси тела мух, были выражены в аналогичных моделей и, как представляется, играют аналогичную роль в нормативно позвоночных и другие филе животное, несмотря на относительно большое (> 70%) расхождение в Hox последовательностей генов среди филе (Голландия и Хоган 1988, Лимоны и Макгиннис 2006). Hox гены кодируют факторы транскрипции, так что другие виды транскрипционных факторов были одинаково изучены, равно как и генов, кодирующих другие виды регуляторных белков, таких как сигнальных молекул и их рецепторов. Эти исследования часто производят те же основные результаты: гомологичных генов находятся в дальнем родстве группы животных, а во многих случаях, как представляется, играют аналогичную роль нормативно даже у животных с высокой разошлись планов тела.
Вторым результатом было то, что несмотря на то, развернутых же основной "инструментарий" для построения тела различные планы, многие важные морфологические различия между смежными видами оказались сильно коррелируют с изменениями в экспрессии этих основных регуляторов, поддерживающих Рафф и Кауфмана утверждают, что изменения в области развития регуляторы играют роль в морфологической эволюции. Например, Averof и Патель (1997) Исследовали экспрессию Hox генов в эмбрионы ракообразных и обнаружили, что изменения в переднем выражением сегментарные границы UBX / Абд - соответствовали изменениям в питании по сравнению с ходьбы конечности морфологии в тех сегментах между ракообразных. Аналогичным образом, Кон и TICKLE (1999) Показали, что выражение нескольких Hox гены были расширены вдоль оси тела в питонами по сравнению с мышами, предполагая, что потеря конечностей у змей был обусловлен расширением "шея домена", а не потеря генов, кодирующих ноги.
Взятые вместе, эти выводы, представленные исследователями с парадоксом. С одной стороны, основные механизмы основные раннего развития, таких как Hox гены, широко сохраняющихся расхождений среди фил. Но в то же время, эти гены также лежат в основе развития различных морфологических между более близких видов. В резолюции этого "Hox парадокса "является то, что Генеральная роль многих генов в эмбрион паттернов имеет была сохранена, но точный характер их выражения или их влияние на последующее развитие событий оба изменились. Эти изменения возможны только путем внесения изменений в нормативные взаимодействия, будь то опосредовано через изменения белков или нуклеиновых кислот.
Количество нормативно различия, влияющие на экспрессию генов, которые отличают ракообразных и мышь развития должны быть огромными, и их сортировка, и тем более установить относительный вклад отбора и дрейфа в нормативных изменений, вероятно, является неразрешимой задачей. В отличие от случаев, когда нормативные выражения гена отличается среди более близких видов обеспечить практические возможности вникать в генетической основы нормативного взаимодействия и выяснить, как именно ген взаимодействий меняться в ходе эволюции. Например, некоторые виды фруктов лету показать различия в окраске крыльев, которые, как известно, в результате мутаций в СНГнормативно-регион пигмента гена желтый (Gompel др.. 2005). Это исследование и многие другие поддерживают утверждение, что изменения в СНГнормативно-регионы могут иметь важные последствия для их адаптации и эволюции новых признаков посредством влияния этих мутаций на экспрессию генов (Рей 2007).
Изменения в нормативно взаимодействия, такие как те, которые изменяют выражение желтый, в значительной степени были изучены в каждом конкретном случае на индивидуальной основе. Несколько недавних генома масштабе технологии открывают возможности для расширения масштабов расследования с конкретными генами и генных взаимодействий (потенциально, по крайней мере) все гены и взаимодействия закодированы в геноме данного вида. Есть несколько биологических системах, для которых мы понимаем закономерностей связей между генами достаточно подробно, чтобы быть в состоянии обсуждать эволюцию экспрессии генов в контексте местных сетей взаимодействия. Эти новые технологии уже оказывают представление о том, как нормативно взаимодействий развиваются и видами воздействий эти нормативные изменения на организменном фенотипа. В оставшейся части этой статьи мы рассмотрим, как эти новые технологии могут быть использованы для понимания причин и последствий изменения генной взаимодействия. Мы сосредоточимся на четыре конкретных вопроса: (1) Как часто это изменение экспрессии генов внутри и между видами? (2) Какие виды генетические изменения лежат в основе изменений в экспрессии генов? (3) Каким образом природные селекционная работа с формой гена взаимодействия? и (4) Какие изменения в генных взаимодействий производит черту различия?
Как часто встречается изменение экспрессии генов?
Первый шаг в понимании того, как генная взаимодействий развиваются между видами задать еще два основных вопроса: (1) Как часто профили экспрессии генов различаются между родственными видами? и (2) Как часто выражение различия, связанные с генетическими против nongenetic (например, экологических) факторов? Опробование профиля экспрессии генов, используя традиционные методы, такие как Северная клякс, это долгий и трудоемкий процесс. Хотя многие случаи были выявлены в котором профиля экспрессии генов явно отличается между двумя видами, по-прежнему трудно поместить эти результаты в более широком контексте генетические. Ли особенности экспрессии гена другие изменения в то же время как ген интересов? Есть ли различия между особями в пределах вида? Как часто изменения в экспрессии генов развиваться в целом? Отличается ли это между различными видами гены?
Новые технологии для проб экспрессии генов делают легче собрать выражения измерения необходимы для ответа на эти вопросы, используя несколько генов, нескольким лицам, а также нескольких видов. Первый крупный прорыв произошел с изобретением микрочипы (Рисунок 1a). Многие из первых исследований с использованием микрочипы проводились с использованием дрожжей. Уже давно известно, что некоторые штаммы дрожжей растут лучше при определенных условиях. Фэй и его коллеги (2004) Спрашивает, какие гены позволят Некоторые штаммы дрожжей, чтобы справиться с тяжелыми металлами в их среде, а другие не могут. Они подняли разных штаммов дрожжей на средах, содержащих возрастающие объемы меди, и тогда измеряется экспрессии генов помощью микрочипов, что испытывали наиболее известных генов в геноме дрожжей. Хотя выражение несколько сотен гены изменилась в ответ на медь в одной или нескольких штаммов, только 20 из этих изменений были связаны с устойчивостью к меди через штаммов. Использование геномной подхода, исследователи смогли сузить поле поиска генетической основы для меди терпимости от всего генома (> 7000 генов) до менее чем через два десятка генов, число генов, кодирующих белки, участвующие в стрессовой реакции и металла, которые были обязательными дифференциально регулируется в штаммы наиболее терпимых к меди. Важно отметить, что стало ясно в последующих исследованиях, в которых ни один из генов определила было достаточным только для производства меди терпимости. Фэй и его коллеги (2004) Таким образом, удалось показать, что в то время как медь негативно сказывается на росте всех штаммов дрожжей, виды в целом принесли некоторых генетически обусловленный изменением в экспрессии генов, что позволило ей адаптироваться к изменениям в размере меди найдены в его окружении, хотя и не изменения, затрагивающие одно гены появились достаточные для управления Эволюция меди терпимости.
Другие скорейшего применения микрочипы на эволюционную проблему, связанную killifish, Fundulus heteroclitus, Член семьи гольян распределение которых простирается от Мексиканского залива в штате Мэн. Ряд публикаций ранее показали, что население killifish локально адаптированных к теплым и холодным температуре воды через эту широкого географического охвата (в обзор Hochachka и Семеро 2002). Исследование Oleksiak и его коллеги (2002) Использовали микрочипы для расследования, сколько и какие гены различаются между выражением и среди рыб от теплой и холодной воды населению. Их результаты оказались поразительными. Целых 18% всех локусам существенно отличались в своем выражении между людьми из того же населения, предполагая, что природные популяции могут гавани огромное изменение в экспрессии генов, гораздо больше, чем было ожидать, на которых отбор потенциально может действовать. Но в то же время, не было гораздо больше различий в экспрессии генов между различными местами по сравнению с пределами мест, считают, что значительное количество наблюдаемых изменений экспрессии генов между видами может быть результатом дрейфа, а не естественный отбор.
Синтез ДНК в настоящее время используются в различных эволюционных и экологических исследований. Результаты подтверждают тот же основной вывод: особенности Экспрессия генов может быть чрезвычайно переменная между видами и населения, и эти различия могут играть адаптивную роль. Но в то же время, большая часть различий в экспрессии генов между видами профили могут быть результатом эволюции или нейтральным экологические различия, указывает на необходимость тщательно разработанные эксперименты включение нескольких биологических реплицируется.
Синтез ДНК были также использованы в развитии биологических исследований, направленных на выведение какие гены взаимодействуют в процессе разработки. Одним из наиболее изученных генной сети в развитие сети в эмбрионе морского ежа. Первоначальных взаимодействий в рамках этой сети потребовались десятилетия, чтобы выяснить, используя традиционные методы для измерения экспрессии генов, таких, как Северная кляксы и количественный ПЦР. Микрочипов и аналогичные технологии имеют значительно увеличило скорость, с которой взаимодействие обнаруживаются и добавляются к сети. Например, подвергая развивающихся эмбрионов для химических агентов, которые возмущают эмбриональное формирование оси, а затем измерение выражением тысяч генов на микрочипы, исследователям в Германии (Poustka др.. 2007) Смогли определить десятки потенциального взаимодействия в первый раз. Другие исследования пошли еще дальше, используя целенаправленные нокдаунов конкретные гены, а затем генома измерения выражение для выяснения основной структуры, ранее неизвестных генной сети (Имаи и др.. 2006, Су и др.. 2009).
Хотя микрочипы являются чрезвычайно полезными для понимания генетических сетей, они имеют ряд существенных недостатков (Рисунок 1a). Во-первых, потому что микрочипы опираться на точную или почти точное соответствие между РНК (мРНК) стенограммы гены изучаются и нити ДНК (олигонуклеотиды), который прилагается к чипу, последовательность генов ведется расследование должны быть известны заранее . Любая последовательность разницу между стенограммы в стадии расследования и зондов на микрочипе может вмешиваться в гибридизации, что делает этот подход трудно применять к эволюционному сравнений в рамках вида даже с умеренным уровнем генетической изменчивости, и гораздо менее полезны для сравнения между видами.
Рисунок 1. Высокая пропускная способность измерения экспрессии генов. Большинство методов измерения экспрессии гена начинается с изоляцией из молекул мРНК из клеток, тканей или организмов интересов. Эти мРНК затем обратной транскрипции, чтобы получить дополнительный образец ДНК (кДНК) молекул (ДНК-копий оригинальных мРНК), используя методы, которые сохранить оригинальные пропорции различных мРНК. В этой графической, каждая цветная линия представляет собой различные молекуле мРНК. Два были разработаны методы, которые могут измерить относительный избыток десятки тысяч различные мРНК одновременно. (а) первый такой метод основан на микрочипы, небольшие стеклянные слайды на которых тысячи микроскопических пятна были напечатаны, содержащие короткие участки ДНК, которые являются дополнением к мРНК, ведется расследование. КДНК, который должен быть измерен с помечены флуоресцентным красителем и гибридизации ДНК-микрочипов. Лазер используется для возбуждения красителей. Уровень флуоресценции пропорциональна числу помеченных стенограмм, связанных на область слайда. (B) Альтернативным подходом является использование высокой пропускной способности технологии секвенирования (Врезка 1). Число раз, которое прочитал кДНК соответствующий отдельному гену пропорциональна его изобилие в общем пуле. Поскольку это теперь возможно последовательность миллионы такой "метки" в один проход, точность измерений является достаточно хорошим. Существует не нужно знать точную последовательность гена под следствием, потому что кДНК определяется в то же время, его концентрация измеряется. Это является важным преимуществом в эволюционных исследованиях, где полным-геномных последовательностей могут быть недоступны для некоторых видов, находящихся под расследованием.
Новые технологии полагаясь на ультра высокой пропускной секвенирования ДНК (Рисунок 1b, Врезка 1) Обойти эти проблемы (Ванг и др.. 2009). Основным методом высокой пропускной последовательности предполагает использование индивидуальных мРНК от общего количества протоколов и последовательность ее определить, какой ген они пришли. Это делается в миллионы раз на пробу, предоставляя информацию о последовательности гена а также измерения относительного изобилия своих сообщений независимо от каких-либо предварительных знаний о последовательности генов. Эти новые технологии также имеют то преимущество, что может точно оценить концентрацию даже низкий-мРНК изобилия. Эта функция имеет особое значение для изучения генной сети, где много функциональных компонентов, таких как транскрипционных факторов, которые обычно высказанные на низком уровне, как 10 молекул в клетке. Хотя эти технологии являются новыми, они уже обратились захватывающие выводы, такие, как откровение, что существует значительное число некодирующей РНК и антисмысловых стенограммы в геноме (Он др.. 2008). Функциональных последствий изменений в этих стенограмм некодирующей РНК является активной областью исследований.
Какое изменение молекулярных взаимодействий более эволюционно время?
Геном масштабе технологии используются также определить многие конкретные виды изменений в генных взаимодействий, лежащих в основе изменений в экспрессии генов. Генные сети часто изображается как линии, соединяющие имени ген, который создает впечатление, что все взаимодействия имеют ту же природу. В действительности, гены могут взаимодействовать различными способами: белковый продукт одного гена может влиять на экспрессию генов другого, белковые продукты из двух разных генов могут образовывать сложные функции которого зависит как один белок может фосфорилируют или другого расщепляющие белки , и так далее.
Обнаружение и характеризующие каждый из этих видов молекулярных взаимодействий требует различного функционального анализа, который представляет собой значительную практическую задачу. Дрожжи дигибридную анализ является одним из самых ранних генома масштабе функциональных проб разработаны определить взаимодействие, и привело к первому графического представления такого взаимодействия в геноме масштабе (Вставка 2). Однако, дрожжи дигибридную анализы имеют свои недостатки: они более трудоемкие, чем большинство генома масштабе подходы, и они генерируют большую часть ложных срабатываний. Хотя некоторые исследования выявили эволюционные изменения в белковых взаимодействий в отдельных генов, генома масштаб сравнений белков организация белка сеть остается проблемой для эволюционных исследований.
Значительно больший прогресс был достигнут в изучении эволюции белок-ДНК взаимодействий между геномом. Ключевые технологии, называемые ChlP-чипа или чип-SEQ (где Обломока выступает за хроматина Иммунопреципитация), включает в себя химическую крепления белка ДНК в живых клетках, что привело к фрагментации ДНК, а затем восстановления фрагментов связаны специфические белки, чтобы выяснить, где в геноме протеин связывает. Этот подход также извлекли пользу из генома технологий масштаба (Вставка 2). Исследование Одом и коллег (2007), Этот подход используется для сравнения обязательных местах по всему мыши и геномов человека в течение четырех факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов в печени. Они обнаружили, что все четыре фактора транскрипции сохранили те же предпочтения последовательности при связывании с ДНК в двух видах. Примечательно, однако, конкретные места, где транскрипционных факторов, связанных в геноме зачастую разные, с 41% до 89% от сайтов связывания настоящему только в одном виде, в зависимости от транскрипционных факторов.
Эти результаты показывают, что конкретный межмолекулярных взаимодействий может перевернуться, даже в тех случаях, когда их функциональные последствия эволюционно сохраняется. Аналогичные результаты наблюдались также для белковых взаимодействий ДНК у дрожжей и плодовых мушек (Цзинь и др.. 2001, Брем и др.. 2002), Предполагая, что изменения в белок-ДНК сайтов связывания не может быть редким явлением даже в относительно короткие эволюционном масштабах времени. Это намек, что регулирующие взаимодействие может быть более динамичной, чем эволюция функцию белка, но они также указывают на важный пробел в наших знаниях: У нас мало информации о последствиях Большая часть этих изменений на экспрессию гена или организменном черты. Решение этой проблемы является следующим важным шагом в понимании того, как генная взаимодействии развиваться.
Вставка 1: Ultra High-пропускном секвенирования ДНК технологии.
Для получения дополнительной информации см. Shendure и Цзи (2008).
Roche/454: Небольшая биотехнологическая компания, называется 454 разработан первый "следующего поколения" или ультра-высокой пропускной способностью технология секвенирования ДНК, чтобы выйти на рынок (с тех пор компания была приобретена Roche). Эта технология использует pyrosequencing, процесса, который был разработан ранее компания под названием Biotage. Последовательность однонитевый матрице ДНК определяется путем добавления свободных нуклеотидов (А, С, Т, G) по одному в присутствии ДНК-полимеразы, люцифераза, дополнительных ферментов, а последовательность грунтовка. Успешное включение дополнительной базы релизы фотонов, которые могут быть обнаружены при чувствительной камерой. Наблюдая, основанный вызвать высвобождение фотонов, последовательность первоначального шаблона может быть восстановлена. 454 Технология масштабируется до pyrosequencing до сотен тысяч одновременных реакций путем выделения отдельной ДНК шаблонов на шариках, усиливая их эмульсии ПЦР (полимеразная цепная реакция), и ставит их в микроскопических скважин на гексагональной массива. Средний последовательности чтении до 450 пар оснований, на сегодняшний день самый длинный из любого "следующего поколения" секвенирование методом. Как таковой, этот подход хорошо подходит для де-Нова секвенирование генома большой и обнаружение генетических вариантов внутри популяций.
Illumina / Solexa: Другая небольшая биотехнологическая компания называется Solexa (впоследствии приобретенных Illumina) разработала второе поколение технология секвенирования ДНК, которая основана на совершенно ином подходе. Шаблона ДНК и стриженый лигируют универсальных адаптеров, которые затем приводятся в очень низкой концентрации на поверхность. Эти мосты ДНК (прилагается к пластине на обоих концах), усиливаются с помощью ПЦР в около 40 миллионов колонии. Секвенирование осуществляется путем добавления флуоресцентно помечены, обратимы терминаторов (3 'Изменения, С, Т, G), наряду с праймерами к адаптеру и последовательности ДНК-полимеразы. Лазерная возбуждает флуоресценцию каждой колонии и цвет читать с фотокамерой. Терминатор 3 'удаляется ферментативные реакции, и процесс повторяется для создания читает около 35 пар нуклеотидов в длину. Эта технология дает очень большого количества коротких читает, и как таковой, особенно хорошо подходят для измерения экспрессии генов (Рисунок 2B) Или белково-связывания ДНК (см. Вставка 2, ChlP-SEQ).
Applied Biosystems / Agencourt: Третий "следующего поколения" технологий, чтобы выйти на рынок был разработан компанией "Agencourt (поскольку приобретенных Applied Biosystems и продается под торговой маркой твердого тела). Он использует совершенно другой химии для последовательности ДНК, основанный на перевязки. Шаблона ДНК стриженый, добавлены универсальные адаптеры, а затем усиливается эту библиотеку. Секвенирование осуществляется путем последовательного перевязки 9-база одноцепьевые олигонуклеотиды, каждый с различными флуоресцентными этикетку на его центральную базу (nnnnAnnnn, nnnnTnnnn, nnnnCnnnn, nnnnGnnnn). Олигонуклеотидов, которые соответствуют шаблону последовательность скрещиваться, и лазер и камера система используется для определения того, какие базы матчи. Процесс повторяется с помощью ряда первоначальных грунтовки, каждый из которых расположен одной базовой дальше назад на шаблоне, и так далее. Такой подход в настоящее время генерирует до 300 миллионов читает около 50 пар оснований, и имеет аналогичные приложения к технологии Solexa.
Вставка 2. Методы оценки прямых молекулярных взаимодействий по всему геному.
Дрожжи дигибридную анализов: Этот подход можно идентифицировать белки, которые взаимодействуют друг с другом, проверяя их сходство в живых клетках дрожжей. Это обычно делается с ссылкой на конкретный протеин интереса ( "приманка"), которая проверяется в отношении всех других белков в геноме. Библиотека построена из ДНК организма, объединяя каждый ген одного из членов пары белков, необходимых для включения гена-репортера, таких как LacZ. Ген, кодирующий белок приманки закрепляться на другого члена пары активатор. Библиотека генов, кодирующих белки потенциальные interactor затем трансфекции в дрожжевых клетках, с одной построить на каждую камеру. В любой камере, где клонированные белка связывается с белком приманки, две половинки активатор будет доведено достаточно близко друг к другу на диске выражения гена-репортера. Дрожжи колонии выразил корреспондент ген можно определить визуально (они будут синего, например, если выразив LacZ в качестве репортера). ДНК клонов содержащиеся положительные клетки затем изолировать и последовательность для выявления которых белка взаимодействует с приманкой белка.
CHIP-чип и ChlP-SEQ: Этот метод определяет, куда конкретного белка связана с ДНК в живых клетках, и используется для определения того, какие гены данный фактор транскрипции регулирует. Клетки фиксированных формалином для связывания транскрипционных факторов в конкретный отрезок ДНК в настоящее время они регулируют, и ДНК стриженый на относительно коротких участках. Антитела специфичны для протеина интереса используется для захвата белок-ДНК комплексов. ДНК затем удаляются из белков и определить либо путем гибридизации на микрочипе, состоящая из всех областей генома под следствием или, чаще, путем секвенирования ДНК бассейна использования высокопроизводительных технологий таких как секвенирование Solexa (см. Врезка 1). Это определяет конкретные сегменты, которые являются функциональными нормативно памятников этого типа клеток в соответствии с конкретными экологическими условиями.
Где естественный акт отбора в геноме?
Синтез ДНК и другие высокой пропускной методы измерения экспрессии генов было выявлено, что изменения в экспрессии генов, очень распространены среди людей и среди видов, и есть доказательства, что эти изменения вызваны, по крайней мере частично, к изменениям в генной регионах даже более краткое эволюционном масштабах времени. Тем не менее, мы очень мало знаем об эволюционных механизмов, приводящих к этим изменениям. Предположительно, некоторые различия экспрессии генов являются результатом естественного отбора, а возможно, большинство различий в связи с последствиями случайных мутаций и дрейфа.
Из положительного отбора, негативный отбор и дрейф (нейтральная эволюция) Написать различные модели изменений в геномах, сравнение ДНК может быть использована для вывода, в какой мере естественный отбор и дрейф повлияли на эволюцию конкретные гены или участки ДНК известной ( или предполагаемых), которые будут участвовать в регуляции экспрессии генов. Несколько статистические тесты были разработаны для этой цели, однако большинство из них на своей основной общей идеей: Сравнение скорости, на которых накапливаются изменения последовательности в гене или регион представляет интерес для (около) область известна или предполагается, что развивающийся нейтрально. Если область интересов показывает значительно более высокие темпы изменений, чем нейтральные регионе, то это является свидетельством положительного выбора. Если область показывает значительно ниже темпов изменений, то негативный отбор, скорее всего, выступающих против изменений в этом регионе. Подобные темпы изменения позволяют предположить, что область интересов развивается нейтрально.
Традиционно, эти тесты для отбора были применены отдельных генов и регуляторных элементов. Тем не менее, исследователи все чаще обращают свои взоры на обследования естественного отбора на уровне генома в целом, чтобы задать вопросы о тенденциях развития широких тенденций, которые нельзя рассматривать с точки зрения отдельных генов или регуляторных элементов. Первый генома сканирует сосредоточено на изменениях в белок-кодирующих областей генома. Кларк и его коллеги (2003) И Нильсена и его коллеги (Нильсон 2005, Нильсон и др.. 2005) Провели одними из первых генома сканирует для положительного отбора, сравнивая шимпанзе и человека. Они обнаружили, что гены, участвующие в иммунном ответе, в среднем, более вероятно, существуют доказательства адаптации, чем большинство других категорий генов. Этот результат соответствует ожиданиям: иммунная система находится под постоянной осадой патогенами и, следовательно, постоянной адаптации к новым вызовам. Удивительно, однако, гены, участвующие в разработке и нейронные нейронной функции как группа не показала каких-либо доказательств адаптации. Другие исследования впоследствии подтвердил эти выводы, однако оставил открытым вопрос о том, какие виды мутаций способствовало резкому эволюции человеческих размеров головного мозга и когнитивные функции.
Одной из возможностей было предложение короля и Уилсон (1975), Что в основе многих адаптаций будут найдены в регуляторных взаимодействий. Haygood и его коллеги (2007) Изменили подход, используемый для моделирования белок-кодирующих областей и использовать его для поиска положительного отбора действующей на вероятность нормативно районами в ходе эволюционного расхождения людей и шимпанзе. Результаты выделил две категории генов, регуляторных районов, в большинстве случаев существуют доказательства положительного отбора на ветви, ведущие к человеку, но не на ветви, ведущие к шимпанзе: гены, участвующие в рацион питания и обмена веществ и генов, участвующих в нейронной развития и когнитивных функций . Эти категории имеют смысл в свете человек-специфические черты, так как наш рацион и познание различных выбросов среди высших приматов. Это исследование также показало, что гены доказательства для адаптивных изменений в нормативно участки ДНК, чем в белок-кодирующих областей, поддержку короля и идея Вильсона, что изменения в регуляции генов играет важную роль в адаптации.
До сравнительно недавнего целых геномов были доступны только для модели организмы, такие как Дрозофилы и Caenorhabditis Elegans. Но, как расходы на крупномасштабные проекты секвенирования снизилась, геномы более nonmodel организмы быть последовательной. Это было достигнуто в основном за счет уточнения в той же основной химии для секвенирования ДНК, который был изобретен более 30 лет назад, но тенденция в целом-секвенирование генома устанавливается для ускорения как ультра высокой пропускной последовательность подходов, упомянутых выше, были привлечены к медведь о геномах. Три из этих методов реализуются (Врезка 1), И больше находятся в стадии разработки. Каждая из этих "следующего поколения" технологий секвенирования использует различные основной химии, и все они отличаются от метода Сэнгер, который доминировал в области молекулярной биологии в течение последних двух десятилетий. Что они имеют в общей огромен масштаб. В то время как структуры ДНК использовали для проекта "Геном человека" добыло около 60 тысяч баз в один прогон, ультра-высокой пропускной способностью секвенсоров может производить млрд. или более. Стоимость За базу для секвенирования ДНК на эти документы составляют лишь ничтожную долю от стоимости использования предыдущего поколения технологий.
Какие изменения в генных взаимодействий производит черту различия?
Другой областью, где применение новых технологий в геноме масштабе наборам данных оказывает влияние в определении, какие гены и мутации влияют на эволюцию частности черты. Даже в тех случаях, когда ясно, что профиля экспрессии генов изменилась, или в которых существует сильная подписания положительного отбора, он редко бывает очевидной организменном чертами которого страдают. За более чем столетнюю историю, стало ясно, что многочисленные гены влиянием изменений во многих качеств, в том числе различные аспекты морфологии, поведении и физиологии (Линч и Уолша 1998). Области количественной генетики развитые мощные статистические методы для оценки количества генов, влияющих на конкретный признак. Такой вывод требует генетических маркеров с известными координатами в геноме: корреляция между генотипом в частности маркером и черт интерес показывают, что два находятся вблизи друг друга на одной хромосоме.
"У", однако, это понятие относительное. С нескольких десятков маркеров, то расстояние между ближайшими маркером и причинных генов может быть десятки миллионов пар нуклеотидов друг от друга, достаточное пространство для сотен генов. Более маркеров можно обследование, тем тоньше физического картирования. На протяжении большей части 20-го века, были ограничены маркеров к генам, что производится на очевидные различия черты, такие как цвет глаз или форма крыла в плодовых мушек. Эти классических генетических маркеров были чрезвычайно полезны, но мало. Это ограничение начали исчезать с появлением молекулярных методов в изучении эволюционной биологии в 1980-х. Любая последовательность разница может быть использована в качестве генетического маркера, при условии, можно прочитать, или генотип, что регион в геноме. Способность ДНК открывают возможности для обследования много больше маркеров, но представила два новых ограничений, затрат и времени. Генотипирование классических генетических маркеров, это быстро и дешево: Один смотрит на лица и записи их появления. В отличие от генотипа молекулярных маркеров, как правило, требует отдельного генерации последовательности ДНК для каждого маркера в каждом человеке. Затраты и труда поднимаются почти линейно с увеличением числа маркеров обследованных, а в большинстве исследований по эволюционным биологам опрошенных не более нескольких сот маркеров. Для организма, как мышь, то это означает сужения причинной мутации в области, которая состоит из нескольких десятков до сотен генов. Таким образом, эти методы не подходят для определения, какие именно мутации генов, ответственных за фенотипические различия.
Последние технологические улучшения в генотипирование, теперь делают его возможным генотипом более миллиона генетических маркеров одновременно, что позволяет за несколько маркеров генов даже в относительно больших геномов, такие, как наши собственные. Наиболее часто используемые технологии (Рисунок 2) Требует, зная заранее, где генетические вариации распространен в геноме. Хотя это ограничивает использование этой технологии в хорошо изученных систем, таких как люди, увеличения доступности генома последовательности данных от нескольких особей того же вида будет увеличиваться, в какой степени эта технология может быть использована и может заменить это технологии, становится возможным последовательности все лица заново.
Генома генотипирование удалось определить ряд локусов, влияющие на подверженность таким заболеваниям, как диабет II типа. Наиболее общепринятая результатов этих исследований Ассоциации чертой является то, что изменение зависит от взаимодействия между большим числом генов. В двух исследованиях, проведенных в Wellcome Trust (Lettre др.. 2008, Weedon др.. 2008), Более чем 400000 генетическими маркерами были опрошены несколько тысяч человек, чтобы идентифицировать гены, основные различия в высоте. Поразительно, что 10 локусов с крупнейшим вкладом в коллективную высоте объяснить лишь около 2% от генетической основы для различия в высоте между отдельными лицами. Таким образом, представляется, что тысячи ДНК варианты влияния этого самого основного и высоко наследственными анатомическими чертами-большого числа генных взаимодействий по любому счету-без единого генетического варианта с подавляющего влияния на высоте. Этот результат подчеркивает, насколько важно для изучения эволюции генных взаимодействий, а не генами (даже многие гены) в изоляции.
Совсем недавно исследователи начали использовать генома генотипирования для выявления генетических вариантов, влияющих на экспрессию генов (Гилад и др.. 2008). Документ Брем и его коллеги (2002) Является примером власти этого подхода. В этом исследовании, исследователи пересекли два штамма дрожжей для поиска корреляции между ДНК полиморфизма и экспрессии генов. Они выявили 570 генов, выражение под влиянием одного или более локусов. Эти выражения, оказывающих влияние на локусов упал основном на два класса. В первую категорию входили локусов, которые повлияли на выражение лишь одного гена. Этих локусов были расположены в СНГ (физически закрыть), чтобы ген, что они повлияли, по-видимому, проживающие в регионе нормативно ДНК, таких, как промоутер или Enhancer. Другая категория состоит из локусов, что повлияло несколько генов и были обнаружены в Транс (Far From) генов, что они повлияли. Интересно, что многочисленные гены под влиянием одного Транс локус очень часто связаны функционально, предполагая, что изменения в одном нормативно ген может иметь скоординированную влияние на некоторые аспекты фенотипа организма. Брем и его коллеги (2005) Провели последующие исследования с целью определения выражения затрагивающие локусов, влияние которого было замечено только в присутствии конкретного генетического происхождения. Они смогли определить сотнях локусов, влияние которого был виден только при наличии конкретных генотипов локуса в другой, демонстрируя, что многие нормативно взаимодействий разделить эти два штамма дрожжей зависеть от множества взаимодействующих генов.
Рисунок 2. Технологии за генома генотипирования. Одним из наиболее широко используемых платформы для высокой пропускной способности является генотипирование пробирного GoldenGate рынке по Illumina. Для каждого потенциально полиморфного базе заинтересованности в геноме, три грунтовки вводят в реакционной смеси. Первая связывает грунтовка как конкретные бусина с адресом этикетки и nonvariable область гена интерес. (Адресный ярлык, крепко сидит в стеклянных бусин.) Два других праймеров специфичных для одного из двух потенциальных баз в переменную сайта, и каждый помечен с различными флуоресцентного красителя. Бус теперь содержит оба связаны дополнительные молекулы ДНК и флуоресцентной тегов, цвет которого зависит от того, какая из полиморфных базах присутствует в этой последовательности. Лазерное и камерной системой затем используется для одновременного измерения флуоресценции индивидуальной бисером и адресный ярлык на эту бусинку. Цвет флуоресценции показывает, какой из двух возможных оснований, присутствующих на полиморфных сайта.
Выводы
Изменения в регуляции генов лежат в основе многих важных фенотипические различия между видами. Новые технологии позволяют нам изучить последствия и причины изменения в экспрессии генов, таким образом, никогда не возможно, и открываются новые перспективы, как доходы эволюции. Однако все еще существуют значительные проблемы, стоящие перед биологами заинтересована в развитии генной регуляции, не в последнюю очередь в том, как справиться с огромным количеством данных, полученных по новой технологии. Высокий уровень внутривидовой изменчивости в экспрессии генов, а также полигенной характер многих черт интерес будет также создают проблемы, и будут требовать, чтобы биологи используют достаточно больших размеров выборки и тщательно контролируемых экспериментов в полной мере использовать информацию, представленную на новые технологий.
Благодарности
Благодаря Кортни Баббит, Jeni Кроче, и Дженни Дун за полезные комментарии и обсуждения.