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限制酶核酸內切
限制酶核酸內切
| 實驗器材 |
| 實驗器材 |
2X Powerpol MasterMix：60μl
2X Powerpol MasterMix：60μl
ddH₂O：300μl
ddH₂O：300μl
rCutSmart buffer：20μl
rCutSmart buffer：20μl
Sma1 酵素(須保持-20°C低溫維持酵素環境)
Sma1 酵素(須保持-20°C低溫維持酵素環境)
Sma1 primer(Forward)：5μl (使用溫泉菌酵素耐高溫)
Sma1 primer(Forward)：5μl (使用溫泉菌酵素耐高溫)
Sma1 primer(Reverse)：5μl (使用溫泉菌酵素耐高溫)
Sma1 primer(Reverse)：5μl (使用溫泉菌酵素耐高溫)
DUCK DNA：Pekin/Mule/Muscovy：5μl each
DUCK DNA：Pekin/Mule/Muscovy：5μl each
| 實驗說明 |
| 實驗說明 |
1.目的：此次實驗主要在測定目標物種的粒線體DNA，進而判定母親品種
2. 實驗原理：藉由找到目標染色體上的基因序列並切斷後，利用電泳分析DNA，即可辨別性別
| 膠塊製備 |
| 膠塊製備 |
1.材料：
1.材料：
1X TAE buffer 20ml
LE agarous powder 0.3g
Gel stain 1μl
2.製作方法：
將1X TAE buffer 20ml、LE agarous powder 0.3g、Gel stain 1μl混合後加熱溶解，倒入製膠架，放入尺梳帶凝固後製作完成
*小叮嚀*：
*小叮嚀*：
1.膠的基底請使用TAE buffer，切勿使用水製膠造成跑膠失敗
2.agarous powder的百分比越大，跑膠結果越清楚，但製作膠塊時容易凝固
3.跑膠時的電壓越大，速度越快，但產熱也越多，可能造成膠體融化，務必注意
| 關於Gel stain |
早期染劑是使用溴化乙錠，此一物質染色的原理為：色素分子會卡進DNA的雙股螺旋之間將DNA染色
此一物質具有高度致癌性，若操作時不慎接觸人體，容易造成DNA複製時錯誤，致細胞癌變
現今使用的是本次實驗用到的Gel stain，染色機制推測為在DNA不影響機能處進行色素分子的連結以利染色
| 實驗步驟 |
| 實驗步驟 |
在離心管中加入
ddH₂O 42μl2X Powerpol MasterMix：50μlSma1 primer(Forward)：2μlSma1 primer(Reverse)：2μl
DUCK DNA：Pekin/Mule/Muscovy：1μl each
後分裝至四連小離心管
ddH₂O 42μl2X Powerpol MasterMix：50μlSma1 primer(Forward)：2μlSma1 primer(Reverse)：2μl
DUCK DNA：Pekin/Mule/Muscovy：1μl each
後分裝至四連小離心管
在一排新的四連離心管中加入
rCutSmart buffer：5μlddH₂O：24μlSma1 酵素1μl前一步PCR產物20μl
放入電泳槽跑膠
100V/5μl
照射UV觀察跑膠結果
|結果分析 |
|結果分析 |
此次實驗跑膠的結果應與明線最多的DNA 1kb ladder進行位置比對
- Pekin 應呈現被酵素切割後的兩條明線
- Muscovy應呈現未被酵素影響的一條明線
- Mule判定此一混種鴨的母親品種為Pekin或Muscovy
正確的結果
正確的結果
依序從右至左應為： (底線為未加入酵素)Pekin ⇒ Mule ⇒ Muscovy ⇒ 水 ⇒ DNA 1kb ladder ⇒ Pekin ⇒ Mule ⇒ Muscovy ⇒ 水從實驗結果判斷，此一Mule的母系品種應為Pekin
我們的結果
我們的結果
依序從右至左應為： (底線為未加入酵素)
Pekin ⇒ Mule ⇒ Muscovy ⇒ 水 ⇒ DNA 1kb ladder ⇒ blank ⇒ Pekin
⇒ Mule ⇒ Muscovy ⇒ 水
由圖可知，膠塊中第一格和第九格並沒有跑出結果，且Mule的跑膠結果錯誤
由此推測，我們犯的錯誤應為：
1. 有一組樣品中加入的DNA混合不均或是劑量錯誤
2.放入膠塊中的樣品順序錯誤
解決方法：
解決方法：
1.DNA放入膠塊前先行震盪及清楚核對劑量，吸取時注意操作
2.仔細核對樣品順序後再放入，如有更改務必注意紀錄
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