Práctica 4. Actividad de la amilasa salival

1. Explicar la estructura, clasificación y los diferentes tipos de amilasas mediante interacción monitor-estudiante, con la finalidad de comprender su funcionalidad en la digestión de los carbohidratos , apoyándose de la bibliografía de base y lecturas libres.  

2. Aplicar el protocolo experimental en el laboratorio, con el fin de entender como varia la función enzimática de la amilasa salival utilizando pruebas específicas, a partir de bibliografía sugerida y lecturas libres.  

3. Demostrar el efecto de la temperatura, pH, inductores e inhibidores enzimáticos sobre la acción de la amilasa salival, para razonar su importancia clínica-fisiológica, basándose en las referencias bibliográficas propuestas.  

• 1 ml de solución saliva  

• 5 ml de solución almidón al 1%  

• Yodo 

• Prueba de Benedict  

Ejercicio 2: Efecto del pH sobre la acción de la amilasa salival  

1. Tome 7 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1.5 ml de solución saliva 1:9.  

2. Agregue 3 ml de la solución buffer correspondiente a cada tubo (indicado en el cuadro que aparece más adelante).  

3. Deje incubar durante 5 minutos todos los tubos de ensayo.  

4. Agregue a cada tubo 5 ml de solución almidón al 1%.  

5. Proceda a realizar la prueba de Yodo a cada tubo a los 0, 3, 6, 9 y 12 minutos luego de agregado el almidón.  

6. Al cabo de los 12 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos de ensayo.  

7. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos:  

Ejercicio 3: Efecto de la presencia de inductores e inhibidores enzimáticos sobre la acción de la amilasa salival  

1. Tome 5 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1 ml de solución saliva 2:8.  

2. Añada a cada tubo 1 ml de la sustancia indicada en el cuadro que aparece más adelante.  

3. Deje incubar durante 5 minutos todos los tubos de ensayo.  

4. Luego de incubar agregue a cada tubo 5 ml de solución almidón al 1%.  

5. Proceda a realizar la prueba de Yodo a cada tubo a los 0, 5, 10, y 15 minutos luego de agregado el almidón.  

6. Al cabo de los 15 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos de ensayo.  

7. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos:  

El propósito de esta práctica es poder observar como los diferentes contextos en el que se pone a trabajar una enzima puede afectar su efectividad. En estos experimentos se buscaban especificamente los efectos que tienen los cambios de temperatura, pH y el use de inductores e inhibidiores. Se debe recordar que las enzimas son proteínas y como tales es posible deducir los efectos que tendrán estos escenarios. 

Comenzando con la temperatura, se esperaba observar el mejor desenvolvimiento en la solución a temperatura ambiental ya que se teorizaba que las altas y bajas temperaturas iban a desnaturalizar la amilasa y disminuir su actividad. Esto fue evidenciado con los cambios de color en las pruebas de yodo. Mientra más tiempo pasa, se supone que la solución debe ir perdiendo ese color morado oscuro porque la amilasa se va degradando y el yodo no se puede unir con las moléculas de almidón (1). Exactamente esto se pudo observar en la solución de temperatura ambiente. Por el otro lado, la solución a 100 y 0 grados celcius no tuvo cambios relativamente significativos.  

Sin embargo, al momento de hacer la prueba de Benedict los resultados no fueron tan diferentes, como puede ser observado en las imágenes. El almidón se descompone principalmente en glucosa, una azucar reductora. El propósito de usar el reactivo de Benedict era determinar, si se daba el cambio al color naranja rojizo, que se encontraba esta azucar reductora (2). Pero en la realidad, todas las soluciones llegaron a un color amarillo debil, la solución a temperatura un levemente un poco más transparente. Tomando como referencia los resultados de las otras pruebas, es razonable pensar que el reactivo no estaba funcionando de la manera correcta. 

Pasando a la actividad de la amilasa y el pH, la literatura expresa que la amilasa salival tiene actividad enzimática en un rango 6.4 a 7, teniendo valor óptimo de 6.9 (3). Al observar los resultados de la práctica, se puede ver que las soluciones con pH más bajo y más alto fueron los que menos mostraron cambios (y ambos están fuera del rango) y acomprañándo a este grupo la solución con el pH de 5.4, estos 3 a los 12 minutos tenían aspectos casi idénticos en cuanto a color y forma de la solución. Las demás pruebas, en un rango entre 6.0 y 7.4, tenían en común que a parte de un pequeño cambio de color, la mezcla tenía un aspecto poroso. Este grupo es el que más se acerca al rango de pH para la actividad enzimática, sugerido anteriormente. Por último, la solución con el pH de 6.8, el más cercano al pH óptimo, fue la que obtuvo el color más distintivo, pasando de un morado oscuro a un marrón verdoso, incluso el mismo tono que tenía la solución a temperatura ambiental del primer experimento. 

Por último, se hizo el experimento con los inductores e inhibidores. Todos los reactivos produjeron los mismos resultados, al igual que en el caso de las pruebas de bennedict, por lo que se presume que los reactivos no estaban en su mejor condición para ser utilizados en este experimento. Lo único que se podría agregar es que para los 15 minutos, la prueba con NaCl tiene secciones de un color diferente. 

Las proteínas desempeñan un papel esencial al catalizar la aceleración de las reacciones bioquímicas. En esta práctica, se utilizó amilasa salival, una enzima presente en las glándulas salivales encargada de descomponer los enlaces químicos presentes en el polisacárido conocido como almidón. Este proceso resulta en la formación de glucoamilosa, glucoamilopectina y, finalmente, glucosa. Se llevó a cabo un análisis detallado para comprender cómo diversos factores pueden influir en la eficiencia catalítica de esta proteína en particular.

Fue evidente que factores como el pH, la temperatura y la presencia de ciertos compuestos inhibidores o activadores tienen la capacidad de modular la actividad catalítica de la proteína. En ciertos casos, estos factores pueden reducir o incluso anular la eficacia catalítica, mientras que en otras circunstancias, la proteína puede mantener su funcionalidad normal. Además, se observó que en situaciones específicas, la actividad proteica puede experimentar alteraciones parciales, lo que sugiere una complejidad en la respuesta de la proteína a diferentes condiciones ambientales y químicas. Este estudio resalta la importancia de comprender las variables que afectan la actividad enzimática.

1. Lourdes D, Núñez A. PRÁCTICAS DE LABORATORIO 3o CURSO DEL GRADO EN EDUCACIÓN INFANTIL ASIGNATURA: DIDÁCTICA DEL MEDIO NATURAL [Internet]. Rodin.UCA. Available from: https://rodin.uca.es/bitstream/handle/10498/20933/PR%C3%81CTICAS%20DE%20LABORATORIO.pdf

2. LibreTexts. 2.7: Carbohidratos [Internet]. LibreTexts Español. 2022. Available from: https://espanol.libretexts.org/Biologia/Biotecnolog%C3%ADa/Bio-Oer_(CUNY)/02%3A_Qu%C3%ADmica/2.07%3A_Carbohidratos

3. Wikipedia. Amilasa [Internet]. Wikipedia. 2023 [cited 2023 Nov 13]. Available from: https://es.wikipedia.org/wiki/Amilasa#:~:text=Tiene%20actividad%20enzim%C3%A1tica%20a%20un