聽損基因研究

截至目前為止，吾人一共前瞻性收集超過5000個特發性感音型聽損家族、合計6000多名病例，並完成所有病例之「表現型」(phenotype)評估及「基因定型」(genotyping)(圖一)。吾人分析比較所有病例之「家族史」、「過去病史」、「理學檢查」、「聽力檢查結果」及「影像檢查結果」，以作表現型之區分；而於基因定型部分，吾人則用直接定序及次世代定序，依序針對常見及罕見聽損基因進行檢測。

吾人發現，在國人感音型聽損病人中，約有18.6%的患者顯現GJB2的變異，而其中以c.235delC最為常見[1, 2]。此結果與其他東亞人種的研究類似[3, 4]，而歐美研究中較為常見的c.30delG及del(GJB6-D13S1830)兩種變異[5]，則均未見於國人。至於SLC26A4基因變異，吾人發現c.919-2A>G變異遠較其他變異常見，約佔所有變異之76.7% [6-8]；高加索人種中則以p.L236P (16%)、p.T416P (15%)及c.1001+1A>G (14%)等較常見[9]；日本人及韓國人最常見的變異則為p.H723R (53%) [10, 11]，亦顯示國人遺傳性聽損基因流行病學之獨特性。而粒線體m.1555A>G變異於國人聽損人口的對偶基因頻率則相對較低，約為1.9% [12]、及粒線體12S rRNA基因(1.9%)。其它基因如：OTOF、MYO15A、EYA1、KCNQ4、POU3F4、MYO7A、MITF、PAX3、EDNRB、EPS8L2與PTPRQ等，也可見於台灣聽損族群中。

過去幾年，吾人研究團隊也建立了以次世代定序技術為基礎的聽損基因檢測平台。第一代與第二代平台分別涵蓋80個與129個已知的聽損基因。最新的第三代平台，則涵蓋220個基因，包括了1,299,144個鹼基對，共3,647個外顯子。其中4個基因 (GJB2、SLC26A4、FOXI1、KCNJ10) 額外加入「內含子」(introns)、基因上游10,000個鹼基對、與下游5,000 個鹼基對的區域。我們使用Illumina的MiSeq定序儀進行定序，產生300個鹼基對的配對 (paired-end)片段。此外，我們建立了聽損基因檢測之分析流程，串聯BWA、Picard、GATK、Platypus、Pindel、Samtools、BCFtools、bedtools和ANNOVAR等軟體工具，並以Perl程式語言撰寫分析流程，達到全自動的基因變異點位判讀。

目前吾人已經完成超過393個聽損家族之次世代定序聽損基因檢測(圖一) 。在第一代平台中，吾人由所建立之特發性聽損研究世代中，選取12個未能檢測出常見聽損基因變異、但家族史明顯之多病例家族，進行基因變異掃描。我們於6個顯性遺傳家族確認5個導致聽損之基因變異，包括：GJB2基因p.R75Q變異(1家族)、MYO7A基因p.T381M變異(1家族)、KCNQ4基因p.S680F變異(1家族)、MYH9基因p.E1256K變異(1家族)、及GJB4基因p.C169W變異(2家族)。其中KCNQ4基因p.S680F變異及MYH9基因p.E1256K變異，乃未曾報告於文獻之新變異[13]。

第二代平台選取了另外10個多病例聽損家族，一共發現了3個未曾於文獻發表過的新基因變異位點，分別為GATA3基因 p.Phe51LeufsX144 變異[14]、POU3F4基因p.Ala116GlyfsX77變異、以及POU4F3基因p.Lys328Glu (圖二)[15] 。此外，吾人於常見聽損基因檢測無法確認基因診斷之人工耳蝸植入病童，選取12名經三年聽語復健成效仍然不彰之病童、與 30名人工耳蝸植入效果良好之病童，比較兩組病童間基因檢測結果的差異。在12名預後不佳之病童中，3名病童於PCDH15基因帶有2個對偶基因變異，4名病童於DFNB59基因帶有2個對偶基因變異，故計於7名(58%)病童可確認其基因診斷；而於30名預後良好之病童中，亦有7名(23%)經大規模平行定序確認基因診斷，發現變異之聽損基因別為：WFS1基因(1名)、GJB3基因(1名)、ESRRB基因(2名)、LRTOMT基因(1名)、MYO3A基因(1名)及POU3F4基因(1名)[16]。

吾人最新的第三代平台定序表現更優於前兩代平台，平均的定序深度為190倍，99.3%的區域有1倍以上的定序深度，91.8%的區域有30倍以上的深度，100倍以上深度的區域則有72.0%。利用此一平台，我們選取50個未帶有兩個SLC26A4常見基因變異(c.919-2A>G 與 p.H723R) 的內耳大前庭導水管症候群家族進行次世代定序基因檢測，我們在34個家族當中找到兩個 SLC26A4 基因變異，兩個家族中發現 EYA1 基因變異。其中，我們發現一個 SLC26A4 基因的大片段缺失(圖三)，顯示我們的次世代定序檢測平台不但可以偵測出點變異與微小的插入或缺失，對於較大區域的缺失等結構性異常也可以進行檢測，因此達成了高達72%的診斷率。

近年來，吾人的團隊已開始利用次世代定序平台提供臨床聽損基因檢測的服務項目，截至目前為止，吾人一共完成了393例次世代定序聽損基因檢測，其中有138個聽損家族達成基因診斷，診斷率為35.1% (圖一)。若搭配常見聽損基因檢測，在吾人的聽損世代當中，可以達到五成左右的基因診斷率。

而針對剩下五成尚未達成診斷的聽損家族，我們團隊也加入了由美國約翰霍普金斯大學David Valle教授所領導的人類孟德爾遺傳疾病基因檢測跨國計畫 (http://bhcmg.org/)，迄2018年前半已完成近50個聽損家族的「全外顯子定序」(whole exome sequencing, WES)；自2018年起也與國家衛生研究院的蔡世峯教授合作，迄今也完成了24個聽損家族的「全基因體定序」(whole genome sequencing, WGS)。

1.3.1 產前診斷與遺傳諮詢

如同其他遺傳性疾病，吾人已可採行羊水穿刺及絨毛膜取樣等方式，正確且迅速地完成遺傳性聽損之產前診斷。目前臺大醫院已順利完成數十例聽損家族待生胎兒之基因檢測；同時，吾人亦完成亞洲第一例遺傳性聽損之「胚胎植入前基因診斷」(pre-implantation genetic diagnosis, PGD)，亦即，確定胚胎中細胞未帶聽損基因變異後，再予以植入母體子宮，如此可幾乎完全迴避母親再度懷有聽損胎兒的風險，而使父母親得以免除人工流產倫理上的爭議及生理上的煎熬，對母體的保護更為周全[17]。

1.3.2 新生兒聽損基因篩檢

過去的研究證實，兒童聽損若未及早發現，及早治療，將會影響以後的語言和智能發展，故當前國內外學界及臨床界，皆一致肯認新生兒應全面接受聽力篩檢[18]。在國內耳鼻喉科前輩之奔走下，我國自2012年起已推行「全面性新生兒聽力篩檢」(universal newborn hearing screening, UNHS)。然而，全面性新生兒聽力篩檢技術上仍有未能篩檢出輕度聽損及遲發性聽損等侷限，此等侷限能否以其他方式(如基因篩檢)予以彌補，乃值得研究之重點所在。有鑑於此，吾人自2009年起即著手一先驅性研究，迄今共計納入於本院出生之6000餘名新生兒，使其同時接受新生兒聽力篩檢及聽損基因變異篩檢，有問題者並安排出生後三個月之聽力評估、及其後之持續聽力追蹤。結果顯示，新生兒聽損基因變異篩檢可用以偵測兒童輕度聽損[19]及遲發性聽損[20]，故結合新生兒聽力篩檢與新生兒聽損基因變異篩檢，可幫助臨床醫師偵測兒童聽損。目前吾人仍持續追蹤此大規模新生兒篩檢研究世代，分析新生兒聽損基因篩檢之長期成本及效用、以及其對於整體社會醫療資源的影響。

1.3.3 個人化精準醫療

除前述於遺傳諮詢與預後評估之應用外，因基因診斷可提供聽損病理機制的直接線索，故近年學界亦積極研究可否藉由基因診斷，達成針對個別聽損病人進行「個人化精準醫療」(precision medicine)之目標。目前學界著力較深者，乃重度聽損病人人工耳蝸植入之治療成效。人工耳蝸植入手術及術後聽語復健需耗費鉅額社會成本，然其成效變異頗大，若能於植入手術前即能預測病人之預後，不僅可幫助病人、家屬、醫療人員及聽語復健人員於術前建立合理期待、並及早擬定聽語復健計畫，亦有助於醫療資源及社會資源之妥善分配。過去的研究雖已發現可能影響人工耳蝸植入效果之諸多因素，惟目前仍欠缺實用性指標，以在術前即得精準預測人工耳蝸植入之預後。

吾人過去的研究發現，帶有GJB2、SLC26A4、粒線體12S rRNA及OTOF等四個常見聽損基因變異之病童，因其聽損之病理位置侷限於內耳，聽神經及中樞神經功能仍為正常，故於接受人工耳蝸植入手術後，均能獲得不錯之效益[21-23]。特別是「聽神經病變」(auditory neuropathy spectrum disorder, ANSD)病人，若能確診帶有OTOF基因變異，因其人工耳蝸效用良好，建議早期植入人工耳蝸，幫助病人獲得最佳成效[24]。

近年，吾人研究團隊更進一步應用「大規模平行定序」技術，研究人工耳蝸植入預後不佳之因子，發現PCDH15基因變異及DFNB59基因變異可能導致聽損病童人工耳蝸植入效果不佳，學理上推測應與此二基因變異所對應之病理位置(即螺旋神經元及聽神經)有關。而帶有PCDH15基因變異及DFNB59基因變異之病童，以現行人工耳蝸植入術前之聽力學及影像學檢查，並無法偵測之，需藉助基因檢測，方能診斷[16]。