基因治療開發

聽損基因人類細胞研究平台：多能性誘導幹細胞(iPSCs)平台之建立: 為建立遺傳性聽損之研究平台，吾人選擇了homozygous及heterozygous之SLC26A4 c.919-2A>G, GJB2 p.V37I及 GJB2 c.235delC此類國人最常見的變異基因型[6, 36, 37]進行多能性誘導幹細胞（iPSCs）之培育(圖七)。吾人在取得病人之血液後離心得到血球細胞，再以Sendai病毒系統進行無血清之iPSCs培育。在得到細胞株後，除針對其表現之特性蛋白進行分析鑑定其本質，更進行其接受誘導而分化之能力之測試，觀察其是否具有分化成為類胚胎體(embryoid body)之能力。目前上述四株人類iPSCs皆已全數建立並完成定性鑑定工作。目前得到之iPSCs正與日本慶應大學Dr. Fujioka合作，進行內耳毛細胞方向之誘導培育，期最終可獲得「誘導型內耳毛細胞」(induced inner ear hair cell) [38]，以應用於進一步的實驗，並在誘導過程中進行基因變異對細胞分化之影響，探討其作為聽損致病機制之可能性。

在各種神經性相關基因變異細胞株建置部份，吾人研究團隊已利用CRISPR/Cas9基因體編輯技術，成功建構帶有人類最常見之SLC26A4基因及GJB2基因變異之細胞株，包括帶有GJB2基因c.109G>A變異及SLC26A4基因c.919-2A>G變異之HEK293T細胞株 (表一)。此外，尚有數株細胞株正在進行中。預計將能做為聽損基因研究之有力研究平台。

腺相關病毒(AAV)之產製與內耳注射

吾人已與哈佛大學Luk H. Vandenberghe教授及David R. Liu教授的實驗室建立合作關係，協助本計畫製備質體及病毒，以及各種技術諮詢。吾人亦與中研院生醫所AAV核心之陶秘華研究員及中研院標靶式操控基因表達核心設施之周祐吉博士取得合作，協助吾人建立病毒及CRISPR相關技術。目前已在動物模式中對Anc80及各種傳統AAV血清型完成初步測試。結果發現Anc80的確對內耳之毛細胞具有高度專一性，而AAV8及AAV9則同時對神經組織具有高度的感染效率

小鼠之基因治療

我們已成功建立小鼠內耳之注射技術，用以導入AAV病毒顆粒。目前吾人已證明基因增補策略可以成功恢復Dfnb59變異小鼠之聽力。吾人將全長Dfnb59基因以Anc80送入P0~2小鼠之左耳，在P45時以ABR測量小鼠之聽力，發現小鼠較治療前（下圖A、B、C）聽力在高頻有明顯回復(下圖D)。本研究為本計畫第一個證明治療效果的小鼠模式。此外，難度極高之胎鼠注射，吾人亦與陽明大學蔡金吾教授合作，建立胎鼠之內耳注射技術。