Recherches

Origines de la vie /Origins of Life

Hérédités / Heredity(ies) 

 Archeobiologie / Archeobiology

Des Briques du vivant dans l'Espace ?

Arts et Sciences / Arts and Sciences

CONTEXTE

De nombreux arguments théoriques et expérimentaux ont conduit à l’hypothèse selon laquelle, au cours de l’évolution, l’ARN aurait précédé l’ADN : c’est l’hypothèse du Monde ARN. Le vivant reposerait sur un plan fondamental bâti autour de l’ARN, à la fois génotype et phénotype, capable de favoriser la formation, la réplication et la catalyse en guidant les premiers pas du métabolisme des toutes premières cellules vivantes.

Dans ce contexte, mes travaux de recherche portent à la fois sur les propriétés informationnelles et catalytiques des acides ribonucléiques, sur les synthèses de motifs structuraux et fonctionnels, ainsi que sur les interactions ARN - cellules, ARN - liposomes et peptides - liposomes dans le but de comprendre les processus de cellularisation. Les motifs ribozymiques que nous étudions ont été trouvés sur des ARNs satellites de virus et sur des viroïdes, les plus petits agents pathogènes des plantes. Les mutants découverts au laboratoire nous permettent de proposer que les ribozymes trouvés dans les viroïdes et ARNs satellites soient des fossiles moléculaires des premières formes de vie.

RESUME DES TRAVAUX ANTERIEURS

Au delà des 4 bases canoniques, plus de 100 nucléosides modifiés ont été répertoriés sur les ARN de transfert et sur les ARN ribosomaux. Plusieurs auteurs proposent que ces nucléosides modifiés soient les reliques d’un ancien Monde ARN plus diversifié et hétérogène que le monde contemporain. L’ancêtre des acides nucléiques (IDA : Initial Darwinian Ancestor) ne présentait probablement pas une structure uniforme et résultait peut-être d’une co-polymérisation de différentes familles.

Dans ce contexte, nous avons montré qu’un nucléoside modifié, le N6-ribosyl-adénine, synthétisé au laboratoire dans des conditions prébiotiques, est aussi actif que l’histidine dans la réaction modèle d’hydrolyse du p-nitrophénylacétate (Maurel et Ninio, 1987 ; Maurel et Convert, 1990 ; Maurel, 1991). De nombreux travaux révèlent que des dérivés N6 ou N3-ribosyl-purine ont pu être des maillons essentiels entre le monde des protéines et le monde de l’ARN (Maurel, 1992). Nous avons par la suite montré que des analogues d’acides nucléiques, tels que les poly(allylamines) greffées par des adénines-N6-substituées, présentent une activité catalytique fortement accélérée dans l’hydrolyse des PNPesters (Maurel et Décout, 1992, 1995 ; Décout et Maurel, 1993, 1995). L’étude théorique et expérimentale du comportement des catalyseurs montre que la coopérativité cinétique a pu apparaître très tôt dans l’évolution et jouer un rôle dans la régulation des premiers évènements métaboliques (Ricard et al, 1996 ; Maurel et Ricard, 2006).

Les capacités catalytiques des ribozymes semblaient, dans un premier temps, limitées, mais une meilleure compréhension de leur fonctionnement et la mise au point de la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment) ont permis d’élargir considérablement le répertoire des réactions catalysées par l’ARN. La méthode SELEX, que nous avons développée au laboratoire, nous a permis de sélectionner des aptamères ARN pour l’adénine dans le but de trouver des catalyseurs utilisant l’adénine ou son dérivé nucléosidique comme cofacteur. Ces ARN, caractérisés par « fingerprint », possèdent en commun 8 nucléotides invariants qui interviennent dans la liaison avec l’adénine (Meli et al, 2002). Ces travaux nous ont conduit à la découverte de deux nouveaux variants du ribozyme en hairpin, porté par l’ARN satellite sTRSV (Tobacco Ringspot satellite Virus). Par sélection in vitro, nous avons isolé deux ARNs strictement dépendants de l’adénine ajoutée comme cofacteur. Ces co-ribozymes - ADHR1 et ADHR2- (Adenine Dependent Hairpin Ribozyme 1 et 2), sont capables de catalyser leur auto-coupure et la réaction inverse (ligation). Il s’agit d’un résultat majeur qui donne lieu aujourd’hui à de très riches applications (Meli et al, 2003).

RÉSULTATS MAJEURS

De nombreux arguments théoriques et expérimentaux ont conduit à l’hypothèse selon laquelle, au cours de l’évolution, l’ARN aurait précédé l’ADN : c’est l’hypothèse du Monde ARN. Le vivant reposerait sur un plan fondamental bâti autour de l’ARN, à la fois génotype et phénotype, capable de favoriser la formation, la réplication et la catalyse en guidant les premiers pas du métabolisme des toutes premières cellules vivantes.

Dans ce contexte, mes travaux de recherche portent à la fois sur les propriétés informationnelles et catalytiques des acides ribonucléiques, sur les motifs structuraux et fonctionnels mis en œuvre, ainsi que sur les interactions ARN - cellules, ARN - liposomes  et peptides - liposomes dans le but de comprendre les processus de cellularisation. Les motifs ribozymiques que nous étudions ont été trouvés sur des ARNs satellites de virus et sur des viroïdes, les plus petits agents pathogènes des plantes. Les mutants découverts au laboratoire nous permettent de proposer que les ribozymes trouvés dans les viroïdes et ARNs satellites soient des fossiles moléculaires des premières formes de vie.

               Résumé des travaux antérieurs

Au delà des 4 bases canoniques, plus de 100 nucléosides modifiés ont été répertoriés sur les ARN de transfert et sur les ARN ribosomaux. Plusieurs auteurs proposent que ces nucléosides modifiés soient les reliques d’un ancien Monde ARN plus diversifié et hétérogène que le monde contemporain. L’ancêtre des acides nucléiques (IDA : Initial Darwinian Ancestor) ne présentait probablement pas une structure uniforme et résultait peut-être d’une co-polymérisation de différentes familles.

          Dans ce contexte, nous avons montré qu’un nucléoside modifié, le N6-ribosyl-adénine, synthétisé au laboratoire dans des conditions prébiotiques, est aussi actif que l’histidine dans la réaction modèle d’hydrolyse du p-nitrophénylacétate (Maurel et Ninio, 1987 ; Maurel et Convert, 1990 ; Maurel, 1991). De nombreux travaux révèlent que des dérivés N6 ou N3-ribosyl-purine ont pu être des maillons essentiels entre le monde des protéines et le monde de l’ARN (Maurel, 1992). Nous avons par la suite montré que des analogues d’acides nucléiques, tels que les poly(allylamines) greffées par des adénines-N6-substituées, présentent une activité catalytique fortement accélérée dans l’hydrolyse des PNPesters (Maurel et Décout, 1992, 1995 ; Décout et Maurel, 1993, 1995). L’étude théorique et expérimentale du comportement des catalyseurs montre que la coopérativité cinétique a pu apparaître très tôt dans l’évolution et jouer un rôle dans la régulation des premiers évènements métaboliques (Ricard et al, 1996 ; Maurel et Ricard, 2006).

               Les capacités catalytiques des ribozymes semblaient, dans un premier temps, limitées, mais une meilleure compréhension de leur fonctionnement et la mise au point de la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment) ont permis d’élargir considérablement le répertoire des réactions catalysées par l’ARN. La méthode SELEX, que nous avons développée au laboratoire, nous a permis de sélectionner des aptamères ARN pour l’adénine dans le but de trouver des catalyseurs utilisant l’adénine ou son dérivé nucléosidique comme cofacteur. Ces ARN, caractérisés par « fingerprint », possèdent en commun 8 nucléotides invariants qui interviennent dans la liaison avec l’adénine (Meli et al, 2002). Ces travaux nous ont conduit à la découverte de deux nouveaux variants du ribozyme en hairpin, porté par l’ARN satellite sTRSV (Tobacco Ringspot satellite Virus). Par sélection in vitro, nous avons isolé deux ARNs strictement dépendants de l’adénine ajoutée comme cofacteur. Ces co-ribozymes - ADHR1 et ADHR2- (Adenine Dependent Hairpin Ribozyme 1 et 2), sont capables de catalyser leur auto-coupure et la réaction inverse (ligation). Il s’agit d’un résultat majeur qui donne lieu aujourd’hui à de très riches applications (Meli et al, 2003).                

               Mécanisme catalytique du sTRSV (ribozyme sauvage) et des mutants ADHR1 et ADHR2

Dans le contexte du monde ARN, l’étude de l’activité catalytique d’un ribozyme sous pression permet d’étudier le comportement de cette molécule dans des conditions extrêmes. De nombreux organismes sont aujourd’hui confrontés à de telles conditions, mais les mécanismes et les comportements des macromolécules sont encore mal compris. Une meilleure connaissance des effets des très hautes pressions sur l’activité des ribozymes permettent d’appréhender le monde ARN de façon plus précise et de mieux en définir les limites et les caractéristiques. Nos résultats sur le ribozyme sauvage et sur les mutants ADHR1 et ADHR2 confirment les hypothèses émises à partir des clichés de cristallographie et mettent en évidence le repliement de la molécule. Ils donnent de plus des informations précises sur l’amplitude de ce repliement (Tobé et al, 2005 ; Hervé et al, 2006, Buck et al, 2009 ; Ztouti et al, 2009). 

               Sélection in vitro d’ARNs résistant à haute température

Les ARNs de transfert résistent à 90°C en présence de NaCl 2M, conservent leur intégrité physique et sont capables d’aminoacylation après traitement à haute température (Tehei et al, 2002). A la suite de cette première observation, nous avons sélectionné, des ARNs résistant 65h à 80°C en présence de sels. Les clones obtenus regroupés en deux familles (Famille I et Famille II) possèdent chacune des caractéristiques physico-chimiques propres ainsi que des structures secondaires différentes. Ainsi les ARNs de la Famille I présentent une structure secondaire comparable à celle de nombreux viroïdes. Ces deux familles reflètent deux voies possibles conduisant à la thermo-résistance. Les comportements moléculaires ainsi mis en évidence nous permettent de définir les limites de survie dans les conditions primitives (et/ou extrêmes), et démontrent que ce qui est en jeu pour les molécules d’ARN, comme pour les organismes, au cours de l’évolution, est la capacité reproductive (Vergne et al, 2006). Enfin, nous avons caractérisé le comportement d’un ribozyme ASBVd à haute température dans des conditions proches de l’hydrothermalisme (El Murr et al, 2012)

               Applications thérapeutiques

La découverte des ARNs catalytiques a permis la conception d’ARNs thérapeutiques capables de réaliser des réactions de trans-clivages. Ce type de ribozyme fixe les substrats par appariement des bases, coupe l’ARN cible, puis relâche les produits de clivage. Dans le but d’inhiber l’expression de deux produits du gène Tpl2/cot, Proto-Cot et Cot, surexprimés dans 40% des tumeurs du sein, Yanli Li, qui a effectué sa thèse au laboratoire, a inséré dans des hairpin ribozymes la séquence de 22 nucléotides provenant du gène Tpl2/cot. Nous avons montré et caractérisé ces nouveaux ribozymes capables de couper en cis et en trans le fragment du gène inséré (Li et al, 2007, 2008, 2009). 

               Aptamères dirigés contre des marqueurs de cellules fœtales

Au cours de la gestation, l’organisme maternel, le fœtus et le placenta sont soumis à de multiples interactions réciproques (Maurel et Kanellopoulos, 2008). L’existence d’échanges cellulaires entre la mère et le fœtus est maintenant bien connue et la recherche de cellules fœtales mâles ou des antigènes HLA spécifiques du fœtus sont les deux stratégies utilisées dans la détection de ce trafic cellulaire. Les PCR et RT-PCR sur des séquences ou des gènes spécifiques du fœtus ou de la mère –sur des modèles murins- ont permis de qualifier ces évènements comme étant fréquents. Cependant seul le développement de techniques permettant d’atteindre des seuils de sensibilité de détection extrêmement résolutifs permettra d’envisager des diagnostics prénataux non invasifs afin de déceler d’éventuelles déficiences ou incompatibilités immunologiques. L'objectif de notre travail, en collaboration avec le laboratoire de Colette Kanellopoulos (UMR 7592) consiste à sélectionner des cellules fœtales grâce à des aptamères identifiés contre des marqueurs spécifiques de ces cellules. De tels aptamères pourront d'une part permettre la purification par affinité des cellules foetales et après pontage, la caractérisation des protéines reconnues par les aptamères.

               Processus de cellularisation.

Les travaux de recherche dans le domaine des origines de la vie cellulaire passent par la compréhension des phénomènes d’auto-assemblage de structures membranaires à partir de molécules amphiphiles. Nous développons des modèles expérimentaux de systèmes cellulaires simples dans lesquels des macromolécules sont encapsulées dans une bicouche lipidique. Des préparations standards de liposomes sont capables de capturer des acides nucléiques et des peptides, et la double couche perméable aux solutés ioniques et polaires permet les réactions de polymérisation dans le volume encapsulé. Nous avons combiné les méthodes d’encapsulation mises au point dans le laboratoire de D. Deamer avec les synthèses peptidiques développées dans mon laboratoire (Maurel et Orgel, 2000). Ceci représente une étape importante vers l’étude d’un système modèle mimant les premières formes de vie (Zepik et al, 2007). Nous utilisons, d’autre part, la spectrométrie Raman exaltée de surface (SERS) pour caractériser un modèle de protocellules ARN / lipides. L’ARN choisi est le ribozyme sauvage sTRSV (Tobé et al, 2005). Nous avons dans un premier temps établi une méthode de détection d'acides nucléiques par spectrométrie Raman exaltée de surface (SERS) [Elamri et al, 2003, 2004, 2005] permettant de détecter des nanomoles d’oligonucléotides en sondant sélectivement les résidus adényls constitutifs. Cette méthode a pu être utilisée pour étudier les cinétiques d'auto-clivage de sub-nanomoles de ribozyme en solution (Percot et al, 2009). 

Etudes fonctionnelles, structurales et dynamique-fonction de ribozymes et de viroïdes ASBVd.  (Hautes pressions, diffusion des neutrons.)

Nous avons montré les capacités réplicatives d’un viroïde ASBVd dans un hôte non spécifique (Delan-Forino et al, 2011). L’étude d’un ribozyme « hammerhead » sous haute pression a montré la plasticité et la dépendance conformationnelle de ces ARNs vis à vis des ions divalents (Kaddour et al, 2011). L’activité, l’auto-association et la structure des ribozymes ADHR1 et ADHR2 ont été étudiées par centrifugation analytique et par diffusion des neutrons. Des interactions tige-tige, boucle-boucle et boucle-tige jouent un rôle majeur dans la régulation de l’activité des deux ribozymes (Li et al, 2008). Par RMN, nous suivons les changements conformationels des états pré et post catalytiques d’ADHR1. L’interaction de l’ARN avec l’adénine est transitoire, la dynamique induite constitue l’étape limitante de la catalyse (Buck et al, 2009). 

A l’interface de la Biologie, de la Physique et de la Chimie, je développe des travaux sur la structure, les fonctions et les interactions des acides nucléiques. Cette démarche est riche d’intérêt et de promesses. Dans un premier type d’approche, bien ancré dans la physique, on cherche à comprendre les lois qui régissent les interactions dans les systèmes biologiques par l’étude expérimentale de systèmes modèles et par la modélisation basée sur les concepts principalement développés en physique de la matière molle. La deuxième approche est basée sur le concept de relation stucture-fonction en biologie : plutôt que de chercher les lois générales, on cherche à comprendre la spécificité, c’est à dire les différences de structure sélectionnée par l’évolution, cela par des études expérimentales physiques, basées sur des méthodes variées, spectroscopies, diffraction, microscopies etc. 

Enfin, je m’intéresse à la relation dynamique-fonction. L’activité d’un système biologique au niveau moléculaire ne dépend pas uniquement de son organisation structurale mais aussi des mouvements qui l’animent. Pour certaines activités, comme la catalyse, une flexibilité accrue se révèle nécessaire. Pour d’autres, comme le transfert d’électrons, c’est au contraire, une plus grande rigidité qui est essentielle. Pour explorer la relation dynamique-fonction, des approches originales sont mises en œuvre : une constante de force effective (la résilience), paramètre mesurable par diffusion de neutrons, est fortement corrélée avec la fonction biologique de systèmes. Cette méthode validée avec succès sur des protéines d’Archaea halophiles révèle que l’adaptation à la température résulte de force qui stabilisent les structures macromoléculaires et déterminent leur flexibilité dans une gamme de valeurs spécifiques. Martine Rihova, étudiante en thèse au laboratoire, effectue en collaboration avec G. Zaccai à l’ILL Grenoble et Ada Yonath du Dept. of Structural Biology, Weizmann Institute Rehovot, Israel, des mesures de dynamique sur un ribozyme, un viroïde isolé et sur le « protoribosome » en différentes conditions de solvant et de température. Nous développons également des mesures de dynamique moléculaire intracellulaire d’archaebactéries halophiles afin de déterminer comment ces cellules sont affectées par la pénétration du viroïde. Le développement et l’application de ce type d’approche méthodologique par spectrométrie, permettant de quantifier les mouvements fonctionnels intramoléculaires, représente un défi important qui pourrait ouvrir un nouveau champ de recherche.  

Nos premiers résultats suggèrent qu’au cours de l’évolution les ARNs sélectionnés présentaient des dynamiques spécifiques qui ont permis le maintien de structures et de flexibilités dans les limites étroites requises pour l’activité biologique. 

Evolution des petits ARNs. Des viroïdes, aux ARN satellites et aux phages .

L’analyse comparative des informations issues des génomes et métagénomes (bactéries, virus, phages, viroïdes) permet d’appréhender leur histoire évolutive, leur origine, leur âge, et d’estimer leur biodiversité en de nombreux points du globe, permettant de quantifier les flux géniques, les transferts horizontaux entre espèces, et leurs conséquences fonctionnelles. Une véritable archéobiologie moléculaire donnera accès à ces paramètres essentiels pour comprendre les mécanismes adaptatifs des micro-organismes à leur environnement depuis les origines et au cours de l’évolution du vivant. Les travaux sont en cours, en premier lieu, à partir de nombreuses données en provenance de phages.

Synthèse de petits ARNs, de fragments et des briques élémentaires d’oligoribonucléotides.

En collaboration avec Jean-François Lambert’s group nous réalisons des synthèses de nucleosides et nucleotides en conditions prébiotiques : En conditions hydrothermales ; en solution ; sur des surfaces minérales (silice, argiles…)

Des briques du vivant dans l'Espace ? 

• La présence de petites molécules telles que l'adénine dans l'espace présente également un intérêt prébiotique soutenu par le CNES. Nous avons mis au point une méthode de détection par spectroscopie Raman (SERS) appliquée à des aérogels envoyés dans l'espace (mission Tanpopo). Collaboration avec la JAXA.

• La mission Tanpopo étudie le transfert interplanétaire de composés organiques prébiotiques et d’intérêt biologique. La 1ère phase de collecte et d'exposition s'est déroulée de mai 2015 à février 2018 à l'aide d’une installation exposée et située à l'extérieur de Kibo, le module expérimental japonais de l’ISS. La mission, conçue et exécutée par le Japon, recueille la poussière cosmique à l'aide de gel de silice à très faible densité (aérogel) afin de l’analyser pour y détecter les composés après leur retour sur Terre. Le principal chercheur est Akihiko Yamagishi, qui dirige une équipe de chercheurs de 26 universités et institutions au Japon, dont la JAXA.

• A la suite de nos premiers travaux (El Amri, C., et al.) qui portaient sur la détection de l’Adénine dans des météorites, par spectrométrie Raman, le Pr. Akihiko Yamagishi, a pris contact avec nous au titre de la mission Tanpopo pour nous proposer une collaboration spatiale dans le but de rechercher des molécules d’intérêt biologique. L’objectif est de mettre au point une méthode d’analyse performante pour la détection des briques élémentaires d’acides nucléiques, mais également de briques et composés protéiques au sein d’une matrice. L’axe de recherche présenté ci-dessous est en continuité avec les travaux déjà réalisés avec l’aide du CNES, dont une partie a fait l’objet des travaux post-doctoraux de C. El Amri (post-doc CNES : 4 articles publiés pendant son post-doctorat).

• Ces travaux ont été repris et étendu à des molécules plus grosses que l’Adénine, voire des oligoribonucléotides (Percot et al, 2009). Il s’agit d’un projet avec une spécificité d’outil et de méthode spectroscopique et spectrométrique.

• Plus spécifiquement, notre objectif est d’abaisser le seuil de détection et d’activité de l’adénine et de tous composés purique/pyrimidique (Maurel et al, 2019), puis celui d’autres petites molécules biologiques tels que des acides aminés-peptides, qui tous pourraient être contenus en quantités infimes dans les poussières extraterrestres piégées par l’aérogel de Tanpopo.

• Pour ce faire, nous nous appuyons sur les spectroscopies Raman et SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy) qui devraient nous permettre d’obtenir des cartographies chimiques 3D des échantillons d’aérogel de Tanpopo. L’Institut d’Astrophysique Spatiale (IAS, CNRS - Univ. Paris Sud-Orsay) se joint à nous pour la suite du projet. L’équipe « Astrochimie et Origines » y a développé une expertise de longue date dans l’analyse de matière extraterrestre de taille micrométrique, telle que les poussières cométaires collectées par la mission Stardust ou les poussières interplanétaires (IDP) collectées par la NASA dans la haute atmosphère terrestre. La collaboration avec l’IAS repose sur l’idée de développer un protocole de multi-analyses coordonnées (Noun et al., Life, 2019, 9, 2, 44) qui dans un premier temps adjoindrait la micro-spectro-imagerie (Dionnet et al., Meteor. Planet. Sci., 2018, 53, 2608-2623) et la micro-tomographie (Dionnet et al, Meteor. Planet. Sci., 2020, accepté) infrarouges (Ligne SMIS, synchrotron SOLEIL) aux mesures Raman et SERS. Cela permettrait d’avoir une caractérisation plus complète des échantillons collectés par Tanpopo et donnerait en particulier un contexte minéralogique aux molécules d’intérêt biologique recherchées par ce projet. Le Pr. Yamagishi nous a confié des échantillons vierges d’aérogel pour mettre au point la détection et calibrer les différents essais. Sa visite en Janvier 2019 nous a permis de lui présenter l’état des travaux. De plus, on sait aujourd’hui miniaturiser des instruments du type Raman et la mise au point d’une nouvelle méthode de détection par ce type de spectroscopie permettra d’explorer les roches et les sols extra-terrestres lors de vols spatiaux susceptibles d’embarquer cette instrumentation.

• Percot, A.; Zins, E.-L.; Al Araji, A.; Ngo, A.-T.; Vergne, J.; Tabata, M.; Yamagishi, A.; Maurel, M.-C. (2019), Detection of Biological Bricks in Space. The Case of Adenine in Silica Aerogel. Life, 9, 82. doi:10.3390/life9040082

Collaborations nationale : Giuseppe Zaccai, ILL Grenoble ; Amel Latifi, IFR 88 CNRS, Marseille ; Jean-François Lambert, Sorbonne Université. Jean-Luc Décout, Université de Grenoble

Collaborations internationale : Ada Yonath, Weizmann Institute Rehovot, Israel ; Kunio Kawamura, Hiroshima Shudo University, Japan ; Akihiko Yamagishi, Tokyo, Japan ; David Deamer, USA, Antonio Lazcano, UNAM and Colegio Nacional Mexico…. …