BEAST2を用いた分岐年代推定

・設定に関して、論文や他のサイトも参考にしつつ、お試しください

・間違えている箇所があれば、メールいただければ幸いです (k.takata013(a)gmail.com)

1)     必要なソフトをダウンロード

BEAST2 (https://www.beast2.org/)

Tracer (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/)

FigTree (https://github.com/rambaut/figtree/releases/tag/v1.4.4)

2)     入力ファイルの作成

※Calibration Pointを用いない解析方法については後述

①    MEGA等を用いて、アライメントを行う

　   ・分岐年代を推定したい系統＋Calibration Pointに使う系統＋外群

・Calibration Pointは化石等を元に設定する。研究対象の先行研究を参考に

・Calibration Pointは分岐年代を推定したい系統内に設定したほうが良い

・系統外にCalibration Pointを置くと、分岐年代が実際より古い結果となってしまう可能性がある

・2つ以上Calibration Pointを置いた方が良い結果を得やすい

・サンプル名にスペースが入っているとエラーが出るので注意。MEGA Xで.fas形式に変換すると、サンプル名のアンダーバーがスペースへ勝手に変換されることがある

②    試しに系統樹を作成してみて、Calibration Pointがしっかり置けているか確認する

③    fastaファイル形式(.fas)で保存する

・複数の領域を組み合わせて解析することもできる。領域ごとにfastaファイルを作成し、BEASTuiで同時に読み込む。同個体の名前は同一名にすること

3)     BEASTuiでの設定

①    ダウンロードしたBEASTファイル内にあるBEASTuiというソフトを起動

②    2)で作成したファイルを読み込む

③    タブPartitions内で目的のファイルが読み込まれていることを確認し、右端のチェックを入れる

④    タブSite Model

(1)   一番上の項目…Gamma Site Model

(2)   Subst Model…Kakusan4などで推定したModelを用いる

・Kakusan4では2)で作成したファイルの名前を～_P.fasに変更し、ドラッグ&ドロップ。ソフト→mrBayesを選択して解析。resultフォルダ内のwhole BIC4で結果を確認する

⑤    タブClock Modelで一番上の項目…Relaxed Clock Log Normalに設定

・ここで進化速度を入力すると95%信用区間が狭くなる。必要に応じてClock rateに入力すること。研究対象と同属・同科で算出された値をできれば用いたい。例えばBufonidaeの12S-16S領域では1.4%/million years（入力する値は0.014）や0.8%/MY(0.008)など。進化速度のみの解析は後述

⑥    Priorsタブ

(1)   Tree…Yule Modelに設定

(2)   Add Priorを押す

(3)   左に外群＋Calibration Pointの片方、右にCalibration Pointの片方とそれ以下の系統のサンプルを移す。Taxon set labelは任意

(4)   新しく作成した項目のタブから、化石情報のCalibration Pointの場合はLog Normalを選ぶ

(5)   新しく作成した項目の左の▶をクリック

(6)   Log Normalの場合、M, S, Offsetを設定する（M=任意, S=0.01など(値の幅を設定) offset=0.0）

・Log Normalで解析するとエラーが出るときがある。その場合はNormalで解析する。

・Normalの場合、Meanに分岐年代を入力する

(7)   (2)～(7)の作業を繰り返し、各Calibration Pointを設定する

⑦    MCMCタブ

Chain Lengthを設定する。デフォルトは10,000,000であるが、10倍以上にしたほうが収束しやすい。なお、300倍以上に設定しても収束しないときは、Calibration Pointの設定が悪い、BEASTuiで何かしらの設定が間違っているなど、根本的なミスをしている気がする

⑧    保存（.xml形式で保存される）

※進化速度を用いた解析方法

塩基の分子進化速度を一定と仮定して解析を行うこともでき（例 19% / MY :クルマエビ類mtDNA調節領域）、進化速度のみを用いて分岐年代推定している論文もそれなりにある。特に化石記録が乏しいなど、Calibration pointの設定が遠縁な分類群を用いないと行えない場合、分子進化速度を用いた解析は有効であると考える。様々な領域の分子進化速度が算出されているので、できれば同科くらいの同じ遺伝子領域の分子進化速度を用いて解析を行うこと

①BEASTuiでアライメントしたfastaファイルを読み込む

②Site ModelタブでSubst modelを選択。Gamma Category Countを4～6の間に設定

③Clock ModelタブでRelaxed Clock Log Normalを選択。Clock. rateを任意の値に設定する。

　　（例えば1.4% / million yearの場合は0.014）

・Strict Clockを使用するのはBayesian Skyline Protなどを除いて推奨されないらしい

④PriorsタブでYule Modelを選択

その他の設定・手順はCalibration pointを使うものと同じ

＊初期系統樹の指定方法

MLやBayesで得られた系統樹とBEASTで作成した系統樹の樹形が異なる場合がある。そこで、信用度の高い、他の解析で得られた系統樹をStarting Treeに指定して、分岐年代推定をすることもできる。

①    Newick treeをFigTreeで作成する。

・Newick treeは系統樹を文章化したもの

・MEGAで作成したNewick treeそのままではエラーが出る

・MEGAで作成したNewick treeを使う場合、メモ帳にコピー&ペーストした後、メモ帳の拡張子を.treeに変えてFigTreeで読み込む。

・FigTreeで読み込んだ系統樹をExport Tree…→ Newick→ Save as currently displayedにチェックをいれてExport

②    BEASTuiの画面の上にあるViewタブから、Show starting tree panelを選択する

③    Starting treeという項目が新しくできるため、選択

④    Initial treeでNewick treeを選択

⑤    Newick treeの欄に作成した系統樹をコピー&ペーストする

⑥    Adjust tip HeightsとAdjust Tree Node Heightsにチェックを入れる

⑦    画面の上にあるViewタブから、Show Operators Panelを選択する

⑧    BEASTに系統推定を行わせないようにするため、Subtree Slide、Exchange: Tree.t ~ Narrow exchange、Exchange: Tree.t ~ Wide exchange、Wilson Baldingの4項目の値を0にする

4)     BEASTでの解析

①    BEASTファイル内のBEASTを起動

②    BEAST XML Fileに3)で作成したファイルを読み込む。

・この際、BEASTと同じファイル内にxmlファイルを置いた方が良い

③    Runをクリック

5)     Tracerでの確認

①    Tracerを起動する

②    File→ Import Tracer Fileで出力された.logファイルを読み込む

③    ESSという値が全て200以上になっているか確認する。200以上ない場合は、BEASTuiでMCMCの値を上げるなど調整した後、再度、解析を行う[3) ⑦も参照]

6)     Tree Annotatorで系統樹の調節

①    BEASTファイル内にあるTree Annotatorを起動

②    Burnin percentageを任意の値に設定（25とか）

③    Input Tree Fileで、4)で出力された.treeファイルを読み込む

④    Output Fileで任意の.tree形式の名前を打ち込む

⑤    Low memoryにチェックを入れる

⑥    Runをクリック

・ファイルサイズが大きいと、パソコンのスペック次第ではエラーを吐く場合がある

7)     FigTreeでの確認

①    Tree Annotatorで出力されたファイルを読み込む

②    外群を選び、Rerootタブを押す

③    左にあるNode Labelsタブを選択する

(1)   DisplayをNode agesに設定

(2)   Font Sizeで文字サイズを調節

④    Node Barsを選択

Displayからheight_95%_HPDを選択すると95%信用区間が表示される

⑤    File→ Export…より、任意のファイル形式で保存

参考文献

・系統解析備忘録_BEAST2による分岐年代推定①（https://evotools.blogspot.com/2019/12/beast2.html）

・バイオインフォマティクス第6回（https://scitech.ksc.kwansei.ac.jp/~tohhiro/bioinformatics2019/Bioinformatics6v2.pdf）

・Key’s website BEAST2の使い方（https://sites.google.com/site/kaysakuma/japanese/ima-migrate-beast/beast2no-shii-fang）

・Beast2 (https://www.beast2.org/)

・分岐年代推定マニュアル（丹羽奎太氏作成、ネット非公開）