以大腸桿菌(E. coli)和枯草桿菌(B.S.)為)為實驗體,練習三種染色法的操作.
細菌中的核酸和鑲嵌在細胞壁上的蛋白質普遍帶負電,故使用帶正電的鹼性染料(本實驗採用結晶紫)能和其互相吸引,而達到染色的效果.
步驟:
一、熱固定
取一片乾淨載玻片,以pipette滴10μL蒸餾水於中央.
以tip沾取些許大腸桿菌(E. coli)菌液,拌入水滴中.
握住載玻片邊緣,迅速在點燃的酒精燈上方過火數次,直到水份完全蒸發.
二、染色
滴一至兩滴結晶紫染劑至玻片上,並靜置一分鐘.
以清水沖掉染劑.
三、觀察
將蓋玻片蓋上,並以100倍油鏡進行觀察、照相.
經簡單染色,一百倍物鏡下的大腸桿菌(E. coli)
和簡單染色法恰好相反,採用帶負電的酸性染劑(本實驗使用Nigrosin 染劑)不會對細菌染色,而是對其周邊的背景染色,以不透光者的陰暗襯托出透光者(細菌)的明亮.
步驟:
一、染色
滴一滴Nigrosin 染劑於載玻片的邊緣.
以tip沾取些許大腸桿菌(E. coli)菌液,拌入染劑中.
以蓋玻片的一邊輕輕將染劑和菌液塗開,並蓋上蓋玻片.
二、觀察
以100倍油鏡進行觀察、照相.
背景經負染色,淡紫色條紋(製作玻片標本時塗抹不均所致)中的白色斑點便是大腸桿菌(E. coli)
只要是細菌,經過簡單染色後都會被染成相同顏色,無法進一步去辨別個體之間的差異.然而,若以碘液處理後,碘和結晶紫所形成的CV-I複合物會牢牢地和革蘭氏陽性菌(G+)的細胞壁結合.而細胞壁中的肽聚醣相對少、脂質相對多的革蘭氏陰性菌(Gˉ)則沒有能固定的地方.因此,在用酒精脫色後,G+菌會維持紫色,而Gˉ菌會被脫色.之後,再以番紅複染,便可將無色的Gˉ菌染成紅色.此為細菌分類的重要依據.
步驟:
一、熱固定
取兩片乾淨載玻片,分別以pipette滴10μL蒸餾水於中央.
以tip沾取些許大腸桿菌(E. coli)和枯草桿菌(B.S.)菌液,分別拌入水滴中.
握住載玻片邊緣,迅速在點燃的酒精燈上方過火數次,直到水份完全蒸發.
二、染色
滴一至兩滴結晶紫染劑至玻片上,並靜置一分鐘.
以清水沖掉染劑
三、媒染
滴一至兩滴碘液至玻片上,並靜置一分鐘.
以清水沖掉碘液
四、脫色
將玻片傾斜,並以95%酒精沖洗,直到流出液變為無色為止.
五、複染
滴一至兩滴蕃紅染劑至玻片上,並靜置三分鐘.
以清水沖掉染劑
六、觀察
將蓋玻片蓋上,並以100倍油鏡進行觀察、照相
經革蘭氏染色,被染成紅色的為大腸桿菌(E. coli),而被染成紫色的則為枯草桿菌(B.S.)
枯草桿菌(B.S.)
革蘭氏陽性菌(G+)
大腸桿菌(E. coli)
革蘭氏陰性菌(Gˉ)
試述細胞壁構造如何影響革蘭氏染色的結果?
解答
細菌的細胞壁若較厚,則會和細胞壁(肽聚醣)分子結合的碘和結晶紫所形成之CV-I複合物會留在細菌身上,使其維持紫色;而若細胞壁中的脂質所佔的比例較高,則被酒精沖洗後,便不會維持紫色.
革蘭氏染色步驟中最重要的步驟為何?請解釋理由.
解答
脫色.此為革蘭氏陽性菌和陰性菌會呈現不同顏色的重要分歧點.
資料來源
2016清大生科科培營第02組網站 sites.google.com/site/2016nthusummercamp02/
細菌的簡單染色和革蘭氏染色 www.mingdao.edu.tw/biological/jeffery/stain.pdf
負染色法 維基百科
https://zh.wikipedia.org/zh-tw/%E8%B4%9F%E6%9F%93%E8%89%B2%E6%B3%95