Chimica Bio-Organica

Anno Accademico 2020/2021

Programma del Corso (DEFINITIVO), valido per gli esami dal 1 Giugno 2021 al 31 Maggio 2022

Il programma è scritto in modo dettagliato affinché possa essere utilizzato anche come guida per lo studio e come mappa concettuale.

SI PRESUPPONE CHE GLI STUDENTI CONOSCANO LA STRUTTURA DEI 20 AMMINO ACIDI

SI PRESUPPONE CHE GLI STUDENTI CONOSCANO LE REAZIONI BIOCHIMICHE PIU' IMPORTANTI (glicolisi e ciclo di Krebbs)

• Breve riepilogo dei principali gruppi funzionali dei composti organici (struttura e reattività)

• Acidità degli idrogeni in alfa ai carbonili: tautomeria cheto-enolica, alchilazione di aldeidi e chetoni, condensazione aldolica, reazione retro-aldolica, condensazione di Claisen, decarbossilazione di beta-cheto acidi, reazione retro-Claisen, immine ed enammine (immina protonata come carbocatione mascherato, enammina come carbanione mascherato, cenni alla alchilazione di Stork). 

  • Glucosio-6P isomerasi: tautomeria cheto-enolica

  • Trioso-fosfato isomerasi: tautomeria cheto-enolica

  • Biosintesi degli acidi grassi (malonil-CoA + acetil-CoA)

  • Acetacetato decarbossilasi: decarbossilazione di beta-cheto acidi

  • Aldolasi: retro-aldolica

• Composti eterociclici aromatici e alifatici: furano, tiofene, pirrolo (pKa 16.5), tetraidrofurano, tetraidrotiofene, pirrolidina, anione ciclopentadienilico, indolo e triptofano, ossazolo, tiazolo, imidazolo (pKa 6.8 e 14.4) e istidina (pKa 6), acidità del tiazolo (pKa 12.7), pirilio, tiopirilio, piridina, ione piridinio (pKa 5.2), pirimidina, citosina, timina, uracile, purina, adenina, guanina, deamminazione della citosina (a dare uracile).

• Prochiralità: sistemi sp2 Cxyz (faccia re e faccia si), sistemi sp3 Cxxyz (pro-R e pro-S), acetaldeide, etanolo, NAD+, NADH, citrato, piruvato, 

  • alcol deidrogenasi (etanolo + NAD+ = acetaldeide + NADH + H+)

  • aconitasi (citrato = isocitrato)

  • citrato sintasi (ossalacetato + acetil-CoA = citrato)

  • succinato deidrogenasi (succinato + FAD = FADH2 + fumarato)

  • ciclo di Krebbs (molti esempi)

• Orbitali: atomici e molecolari, di legame e antilegame, energia degli orbitali, reazioni organiche come interazione tra HOMO e LUMO, allineamento e sovrapposizione degli orbitali, effetti stereoelettronici.

  • effetto anomerico (inattesa stabilità dell'alfa-D-glucopiranosio se confrontato con il cicloesanolo)

  • effetto gauche (forma elicoidale del PEG)

  • effetti stereoelettronici NADH (donazione dell'H pro-R o pro-S a seguito dell'allineamento degli orbitali e deformazione dell'anello nicotinammidico)

  • effetti stereoelettronici nella selezione del legame da rompere per reazioni catalizzate da PLP

  • triosofosfato isomerasi: effetti stereoelettronici impediscono la perdita di fosfato

  • idrossilazione della prolina (prolina idrossilasi) rafforza la struttura del collagene conferendo stabilità all'anello della prolina per effetti stereoelettronici

• Legami delle biomolecole: ammidi (peptidi), esteri, fosfodiesteri. Stabilità dei fosfodiesteri (repulsione elettrostatica nei confronti di nucleofili, costo di re-ibridizzazione, presenza di sostituenti elettronattrattori), acido fosforico e costanti di acidità (pKa 2.12, 7.2, 12.3), ruolo del Mg2+, inversione piramidale come modello della re-ibridizzazione del fosforo, instabilità dell'RNA a causa del gruppo 2'-OH.

  • ribonucleasi A: idrolisi fosfodiesteri

• Termodinamica e cinetica: grafico della coordinata di reazione, deltaG° e deltaG#; significato e stima dell'entalpia (legami covalenti e non covalenti, energia e distanza di legame), significato e stima dell'entropia (gradi di libertà), effetto idrofobico e sua rilevanza biochimica; velocità di una reazione (primo ordine, pseudo primo ordine), equazione di Arrhenius, teoria dello stato di transizione, equazione di Eyring, come ricavare A, Ea, DH# e DS# a partire dalle costanti di velocità (k) misurate a diverse temperature.

• Stato di transizione: natura dello stato di transizione, analoghi dello stato di transizione (TSA) (prolina racemasi, lisozima, proteasi, citidina e adenosina deamminasi, renina, triosofosfato isomerasi, glucosio-6-fosfato isomerasi, ossalacetato decarbossilasi, aspartato carbamoil transferasi)

• Inibitori covalenti (substrati suicida): trapaxin-A come inibitore dell'istone deacetilasi, 5-fluorouracile come inibitore della timidilato sintasi, gas nervini/insetticidi come inibitori dell'acetilcolina esterasi, penicillina come inibitore della DD-transpeptidasi, aspirina come inibitore di una cicloossigenasi.

• Catalisi (Introduzione): confronto tra reazioni non catalizzate e reazioni catalizzate. Esempi di catalisi acido-base (idrolisi degli esteri non catalizzata o base-catalizzata, idrolisi degli acetali (glicosidi) non catalizzata e acido-catalizzata, disidratazione della carbinolammina non catalizzata e acido-catalizzata); esempi di catalisi nucleofilica (piridina e all'idrolisi di anidridi, ioduro sulla sostituzione nucleofilica, imidazolo su idrolisi esteri).

• Classificazione dei meccanismi di catalisi (avvicinamento/orientazione/desolvatazione, catalisi covalente, catalisi acido-base, tensione/distorsione/cambiamenti conformazionali, catalisi ioni metallici)

  • avvicinamento/orientazione/desolvatazione (costo entropico dell'avvicinamento e orientazione, desolvatazione ed effetto idrofobico, modelli molecolari per tener conto dell'avvicinamento e orientazione: confronto tra reazioni uni- e bi-molecolari nell'idrolisi di esteri, "concentrazione effettiva", valore 55.6 M, cenni alla catalisi micellare, cenni al coefficiente di partizione e LogP, aspartato transcarbamilasi come enzima la cui azione è principalmente basata su avvicinamento/orientazione/desolvatazione).

  • catalisi covalente nucleofilica: un nucleofilo attacca il substrato elettrofilo rendendo più veloce la reazione complessiva (occorre che il catalizzatore sia un buon nucleofilo e un buon nucleofugo)

    • in chimica organica: piridina o imidazolo per le reazioni di trasferimento di acile (es. idrolisi di anidridi o di esteri)

    • biotina e carbossilazioni (piruvato carbossilasi, acetil-CoA carbossilasi)

    • fosfoglicerato mutasi (due istidine agiscono da gruppi nucleofilici per il trasferimento di fosfato)

  • catalisi covalente elettrofilica: 

    • Importanza delle immine protonate (basi di Schiff) come 'electron sink'. Esempio: decarbossilazione di beta-cheto acidi (es. acetacetato decarbossilasi) in ambiente acido oppure catalizzata dall'anilina

    • aldolasi (retro-aldolica): catalisi elettrofilica grazie a immina protonata (Lys) e catalisi basica generale (Tyr-O-)

    • tiamina pirofosfato (TPP): acidità C2-H e stabilizzazione dell'ilide; deprotonazione della TPP nella piruvato deidrogenasi; meccanismi di (1) piruvato decarbossilasi,  (2) piruvato deidrogenasi, (3) transchetolasi (C5+C5 = C3 + C7)

    • piridossal fosfato (PLP): struttura, principio di funzionamento di "viniloghi" dei gruppi funzionali, selezione stereoelettronica del legame da rompere; meccanismi di: transaminasi (amminotrasferasi) (rottura legame C-H) seguita da glutammato deidrogenasi, decarbossilasi (rottura legame C-COO-, es. istidina decarbossilasi, glutammato decarbossilasi), racemasi (rottura legame C-H), serina idrossimetil trasferasi (rottura legame Calfa-Cbeta), serina deidratasi (rottura legame Cbeta-eteroatomo)

  • cenni alla catalisi non covalente elettrofilica: rilevanza degli ioni Mg2+ nelle reazioni che coinvolgono la rottura di legami fosfo-anidride o fosfo-(di)-estere, attacco al fosfato alfa, beta, o gamma

  • catalisi covalente per reazioni di ossidoriduzione: reazione di Cannizzaro, meccanismo di gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, glutatione riduttasi, diidrolipoammide deidrogenasi

  • catalisi acido-base: riepilogo nozioni di base, Ka, pKa, calcolo delle concentrazioni di HA e A in base al pH, potere livellante del solvente (H3O+ e OH- acidi e basi più forti presenti in acqua), importanza della tempistica di trasferimento di protoni, trasferimento veloce tra eteroatomi, stadio lento delle reazioni coinvolge spesso la re-ibridizzazione del C,  esempi di meccanismi già noti in chimica organica, catalisi specifica e generale (SAC = pre-protonazione, SBC = pre-deprotonazione, GAC, GBC), acidità/basicità nello stato di transizione, costo entropico della catalisi generale, grafici a coordinata di reazione, equazioni cinetiche, dipendenza dal pH della koss, grafici lineari e logaritmici, indistinguibilità tra GAC e pre-protonazione seguita daGBC, o GBC e pre-deprotonazione seguita da GAC (esempio: primo passaggio dell'idrolisi di immine)

    • Esempi di catalisi acido-base generale: formazione di THF base-catalizzata (borato, carbonato, fenato), esterificazione intramolecolare dell'acido 8-idrossi alfa-naftoico, idrolisi base-catalizzata di O-metilfosfodiestere , idrolisi di anidride acetica catalizzata da acetato, idrolisi di N-acetilimidazolo catalizzata da imidazolo, alfa-iodurazione dell'acetone catalizzata dal tampone acetato

    • Proprietà acido-base degli amminoacidi, valori di pKa di Asp, Glu, His, Cys, Tyr, Lys, Arg, Ser, NH3+ terminale, COO- terminale, alterazioni dovute al microambiente (tasca idrofobica, ponte salino)

    • Esempi di reazioni in cui avviene GAC o GBC o entrambe simultaneamente: serin proteasi e cistein proteasi (GBC + catalisi nucleofilica), carbossipeptidasi (GBC), lisozima (GAC), aldolasi tipo I (GBC + catalisi elettrofilica), RNasi A (GBC e GAC), glucosio-6-fosfato isomerasi (GBC e GAC), triosofosfato isomerasi (GBC e GAC), citrato sintasi (GBC e GAC), aconitasi (GBC e GAC). In chimica organica: catalisi della 2-idrossipiridina / 2-piridone nella apertura del D-glucopiranosio (mutarotazione), difenilprolinolo nella reazione di epossidazione, cenni al concetto di organocatalisi, organocatalisi & catalisi micellare, mini-enzimi.

    • Variazione di kcat con il pH dovuta alla ionizzazione di residui acido-base negli enzimi: modello semplificato di acido diprotico, modello basato su GBC/GAC, grafici lineari e logaritmici, cenni al fatto che una delle due ionizzazioni può essere dovuta al substrato e non ad un residuo amminoacidico dell'enzima.

  • tensione/distorsione/cambiamenti conformazionali: differente capacità di legame dell'enzima nei confronti del substrato e dello stato di transizione, tensione indotta nel substrato. Esempi: lisozima (deformazione da sedia a sofa dell'anello di acido N-acetilmuramico, trattamento dettagliato con i 6-sotto siti di legame), orotidina 5'-monofosfato decarbossilasi (COO- in tasca idrofobica), teorie che spiegano la specificità (adattamento indotto e/o tensione indotta dal substrato vs legame non produttivo di molecole che non sono substrato "naturale" dell'enzima, esempio della esochinasi e sua diversa reattività nei confronti del glucosio o dell'acqua)

• Equazioni di binding, di Michaelis-Menten (MM), MM a diversi pH, MM in presenza di inibitori,  Kd, Km, kcat, kcat/Km (efficienza catalitica), Ki, Ki', 

  • metodi per determinare: pKa1 e pKa2 da curve a campana; Kd: doppi reciproci  - Lineawer-Burk, Hanes, Scatchard; Km e Vmax: doppi reciproci - Lineawer-Burk, Eadie-Hofsteee, Hanes-Wolff); analisi basate su misure spettroscopiche e difficoltà di determinare la massima variazione di segnale DeltaSmax.

• Metodi spettroscopici di comune impiego

  • Spettrofotometria UV-Vis di proteine, cofattori, acidi nucleici

  • Turbidimetria

  • Dicroismo circolare di proteine

  • Spettrofluorimetria di proteine e cofattori, fluorocromi per acidi nucleici

  • Uso di derivati cromogenici e fluorogenici

• Lezione-seminario: Costruzione di sistemi artificiali simili alle cellule: dall'origine della vita alla biologia sintetica.

• Esercitazione 1 e 2: Utilizzo di Excel o analoghi programmi per la modellizzazione del binding e della catalisi chimica e bio-chimica (file Excel dei dati)

• Esercitazione 3: Utilizzo di COPASI per la modellizzazione di reazioni chimiche (link alla pagina web di COPASI)

• Esercitazione 3: Determinazione sperimentale di kcat e Km per la reazione di idrolisi di un peptide cromogenico catalizzata dalla alfa-chimitripsina - mediante spettrofotometria UV-Vis (link alla pagina Sigma-Aldrich del substrato)

Anno Accademico 2021/2022

Programma del Corso (PROVVISORIO), valido per gli esami dal 1 Giugno 2022 al 31 Maggio 2023

Il programma è scritto in modo dettagliato affinché possa essere utilizzato anche come guida per lo studio e come mappa concettuale.

SI PRESUPPONE CHE GLI STUDENTI CONOSCANO LA STRUTTURA DEI 20 AMMINO ACIDI

SI PRESUPPONE CHE GLI STUDENTI CONOSCANO LE REAZIONI BIOCHIMICHE DELLA GLICOLISI E DEL CICLO DI KREBBS

• Breve riepilogo dei principali gruppi funzionali dei composti organici (struttura e reattività)

• Acidità degli idrogeni in alfa ai carbonili: tautomeria cheto-enolica, alchilazione di aldeidi e chetoni, condensazione aldolica, reazione retro-aldolica, condensazione di Claisen, decarbossilazione di beta-cheto acidi, reazione retro-Claisen, immine ed enammine (immina protonata come carbocatione mascherato, enammina come carbanione mascherato, cenni alla alchilazione di Stork). 

  • Glucosio-6P isomerasi: tautomeria cheto-enolica

  • Trioso-fosfato isomerasi: tautomeria cheto-enolica

  • Biosintesi degli acidi grassi (malonil-CoA + acetil-CoA)

  • Acetacetato decarbossilasi: decarbossilazione di beta-cheto acidi

  • Aldolasi: retro-aldolica

• Composti eterociclici aromatici e alifatici: furano, tiofene, pirrolo (pKa 16.5), tetraidrofurano, tetraidrotiofene, pirrolidina, anione ciclopentadienilico, indolo e triptofano, ossazolo, tiazolo, imidazolo (pKa 6.8 e 14.4) e istidina (pKa 6), acidità del tiazolo (pKa 12.7), pirilio, tiopirilio, piridina, ione piridinio (pKa 5.2), pirimidina, citosina, timina, uracile, purina, adenina, guanina, deamminazione della citosina (a dare uracile).

• Prochiralità: sistemi sp2 Cxyz (faccia re e faccia si), sistemi sp3 Cxxyz (pro-R e pro-S), acetaldeide, etanolo, NAD+, NADH, citrato, piruvato, 

  • alcol deidrogenasi (etanolo + NAD+ = acetaldeide + NADH + H+)

  • aconitasi (citrato = isocitrato)

  • citrato sintasi (ossalacetato + acetil-CoA = citrato)

  • succinato deidrogenasi (succinato + FAD = FADH2 + fumarato)

  • ciclo di Krebbs (molti esempi)

• Orbitali: atomici e molecolari, di legame e antilegame, energia degli orbitali, reazioni organiche come interazione tra HOMO e LUMO, allineamento e sovrapposizione degli orbitali, effetti stereoelettronici.

  • effetto anomerico (inattesa stabilità dell'alfa-D-glucopiranosio se confrontato con il cicloesanolo)

  • effetto gauche (forma elicoidale del PEG)

  • effetti stereoelettronici NADH (donazione dell'H pro-R o pro-S a seguito dell'allineamento degli orbitali e deformazione dell'anello nicotinammidico)

  • effetti stereoelettronici nella selezione del legame da rompere per reazioni catalizzate da PLP

  • triosofosfato isomerasi: effetti stereoelettronici impediscono la perdita di fosfato

  • idrossilazione della prolina (prolina idrossilasi) rafforza la struttura del collagene conferendo stabilità all'anello della prolina per effetti stereoelettronici

• Legami delle biomolecole: ammidi (peptidi), esteri, fosfodiesteri. Stabilità dei fosfodiesteri (repulsione elettrostatica nei confronti di nucleofili, costo di re-ibridizzazione, presenza di sostituenti elettronattrattori), acido fosforico e costanti di acidità (pKa 2.12, 7.2, 12.3), ruolo del Mg2+, inversione piramidale come modello della re-ibridizzazione del fosforo, instabilità dell'RNA a causa del gruppo 2'-OH.

  • ribonucleasi A: idrolisi fosfodiesteri

• Termodinamica e cinetica: grafico della coordinata di reazione, deltaG° e deltaG#; significato e stima dell'entalpia (legami covalenti e non covalenti, energia e distanza di legame), significato e stima dell'entropia (gradi di libertà), effetto idrofobico e sua rilevanza biochimica; velocità di una reazione (primo ordine, pseudo primo ordine), equazione di Arrhenius, teoria dello stato di transizione, equazione di Eyring, come ricavare A, Ea, DH# e DS# a partire dalle costanti di velocità (k) misurate a diverse temperature.

• Stato di transizione: natura dello stato di transizione, analoghi dello stato di transizione (TSA) (prolina racemasi, lisozima, proteasi, citidina e adenosina deamminasi, renina, triosofosfato isomerasi, glucosio-6-fosfato isomerasi, ossalacetato decarbossilasi, aspartato carbamoil transferasi)

• Inibitori covalenti (substrati suicida): trapaxin-A come inibitore dell'istone deacetilasi, 5-fluorouracile come inibitore della timidilato sintasi, gas nervini/insetticidi come inibitori dell'acetilcolina esterasi, penicillina come inibitore della DD-transpeptidasi, aspirina come inibitore di una cicloossigenasi.

• Catalisi (Introduzione): confronto tra reazioni non catalizzate e reazioni catalizzate. Esempi di catalisi acido-base (idrolisi degli esteri non catalizzata o base-catalizzata, idrolisi degli acetali (glicosidi) non catalizzata e acido-catalizzata, disidratazione della carbinolammina non catalizzata e acido-catalizzata); esempi di catalisi nucleofilica (piridina e all'idrolisi di anidridi, ioduro sulla sostituzione nucleofilica, imidazolo su idrolisi esteri).

• Classificazione dei meccanismi di catalisi (avvicinamento/orientazione/desolvatazione, catalisi covalente, catalisi acido-base, tensione/distorsione/cambiamenti conformazionali, catalisi ioni metallici)

  • avvicinamento/orientazione/desolvatazione (costo entropico dell'avvicinamento e orientazione, desolvatazione ed effetto idrofobico, modelli molecolari per tener conto dell'avvicinamento e orientazione: confronto tra reazioni uni- e bi-molecolari nell'idrolisi di esteri, "concentrazione effettiva", valore 55.6 M, cenni alla catalisi micellare, cenni al coefficiente di partizione e LogP, aspartato transcarbamilasi come enzima la cui azione è principalmente basata su avvicinamento/orientazione/desolvatazione).

  • catalisi covalente nucleofilica: un nucleofilo attacca il substrato elettrofilo rendendo più veloce la reazione complessiva (occorre che il catalizzatore sia un buon nucleofilo e un buon nucleofugo)

    • in chimica organica: piridina o imidazolo per le reazioni di trasferimento di acile (es. idrolisi di anidridi o di esteri)

    • biotina e carbossilazioni (piruvato carbossilasi, acetil-CoA carbossilasi)

    • fosfoglicerato mutasi (due istidine agiscono da gruppi nucleofilici per il trasferimento di fosfato)

  • catalisi covalente elettrofilica: 

    • Importanza delle immine protonate (basi di Schiff) come 'electron sink'. Esempio: decarbossilazione di beta-cheto acidi (es. acetacetato decarbossilasi) in ambiente acido oppure catalizzata dall'anilina

    • aldolasi (retro-aldolica): catalisi elettrofilica grazie a immina protonata (Lys) e catalisi basica generale (Tyr-O-)

    • tiamina pirofosfato (TPP): acidità C2-H e stabilizzazione dell'ilide; deprotonazione della TPP nella piruvato deidrogenasi; meccanismi di (1) piruvato decarbossilasi,  (2) piruvato deidrogenasi, (3) transchetolasi (C5+C5 = C3 + C7)

    • piridossal fosfato (PLP): struttura, principio di funzionamento di "viniloghi" dei gruppi funzionali, selezione stereoelettronica del legame da rompere; meccanismi di: transaminasi (amminotrasferasi) (rottura legame C-H) seguita da glutammato deidrogenasi, decarbossilasi (rottura legame C-COO-, es. istidina decarbossilasi, glutammato decarbossilasi), racemasi (rottura legame C-H), serina idrossimetil trasferasi (rottura legame Calfa-Cbeta), serina deidratasi (rottura legame Cbeta-eteroatomo)

  • cenni alla catalisi non covalente elettrofilica: rilevanza degli ioni Mg2+ nelle reazioni che coinvolgono la rottura di legami fosfo-anidride o fosfo-(di)-estere, attacco al fosfato alfa, beta, o gamma

  • catalisi covalente per reazioni di ossidoriduzione: reazione di Cannizzaro, meccanismo di gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, glutatione riduttasi, diidrolipoammide deidrogenasi

  • catalisi acido-base: riepilogo nozioni di base, Ka, pKa, calcolo delle concentrazioni di HA e A in base al pH, potere livellante del solvente (H3O+ e OH- acidi e basi più forti presenti in acqua), importanza della tempistica di trasferimento di protoni, trasferimento veloce tra eteroatomi, stadio lento delle reazioni coinvolge spesso la re-ibridizzazione del C,  esempi di meccanismi già noti in chimica organica, catalisi specifica e generale (SAC = pre-protonazione, SBC = pre-deprotonazione, GAC, GBC), acidità/basicità nello stato di transizione, costo entropico della catalisi generale, grafici a coordinata di reazione, equazioni cinetiche, dipendenza dal pH della koss, grafici lineari e logaritmici, indistinguibilità tra GAC e pre-protonazione seguita daGBC, o GBC e pre-deprotonazione seguita da GAC (esempio: primo passaggio dell'idrolisi di immine)

    • Esempi di catalisi acido-base generale: formazione di THF base-catalizzata (borato, carbonato, fenato), esterificazione intramolecolare dell'acido 8-idrossi alfa-naftoico, idrolisi base-catalizzata di O-metilfosfodiestere , idrolisi di anidride acetica catalizzata da acetato, idrolisi di N-acetilimidazolo catalizzata da imidazolo, alfa-iodurazione dell'acetone catalizzata dal tampone acetato

    • Proprietà acido-base degli amminoacidi, valori di pKa di Asp, Glu, His, Cys, Tyr, Lys, Arg, Ser, NH3+ terminale, COO- terminale, alterazioni dovute al microambiente (tasca idrofobica, ponte salino)

    • Esempi di reazioni in cui avviene GAC o GBC o entrambe simultaneamente: serin proteasi e cistein proteasi (GBC + catalisi nucleofilica), carbossipeptidasi (GBC), lisozima (GAC), aldolasi tipo I (GBC + catalisi elettrofilica), RNasi A (GBC e GAC), glucosio-6-fosfato isomerasi (GBC e GAC), triosofosfato isomerasi (GBC e GAC), citrato sintasi (GBC e GAC), aconitasi (GBC e GAC). In chimica organica: catalisi della 2-idrossipiridina / 2-piridone nella apertura del D-glucopiranosio (mutarotazione), difenilprolinolo nella reazione di epossidazione, cenni al concetto di organocatalisi, organocatalisi & catalisi micellare, mini-enzimi.

    • Variazione di kcat con il pH dovuta alla ionizzazione di residui acido-base negli enzimi: modello semplificato di acido diprotico, modello basato su GBC/GAC, grafici lineari e logaritmici, cenni al fatto che una delle due ionizzazioni può essere dovuta al substrato e non ad un residuo amminoacidico dell'enzima.

  • tensione/distorsione/cambiamenti conformazionali: differente capacità di legame dell'enzima nei confronti del substrato e dello stato di transizione, tensione indotta nel substrato. Esempi: lisozima (deformazione da sedia a sofa dell'anello di acido N-acetilmuramico, trattamento dettagliato con i 6-sotto siti di legame), orotidina 5'-monofosfato decarbossilasi (COO- in tasca idrofobica), teorie che spiegano la specificità (adattamento indotto e/o tensione indotta dal substrato vs legame non produttivo di molecole che non sono substrato "naturale" dell'enzima, esempio della esochinasi e sua diversa reattività nei confronti del glucosio o dell'acqua)

• Equazioni di binding, di Michaelis-Menten (MM), MM a diversi pH, MM in presenza di inibitori,  Kd, Km, kcat, kcat/Km (efficienza catalitica), Ki, Ki', 

  • metodi per determinare: pKa1 e pKa2 da curve a campana; Kd: doppi reciproci  - Lineawer-Burk, Hanes, Scatchard; Km e Vmax: doppi reciproci - Lineawer-Burk, Eadie-Hofsteee, Hanes-Wolff); analisi basate su misure spettroscopiche e difficoltà di determinare la massima variazione di segnale DeltaSmax.

• Metodi spettroscopici di comune impiego

  • Spettrofotometria UV-Vis di proteine, cofattori, acidi nucleici

  • Turbidimetria

  • Dicroismo circolare di proteine

  • Spettrofluorimetria di proteine e cofattori, fluorocromi per acidi nucleici

  • Uso di derivati cromogenici e fluorogenici

• Lezione-seminario: Costruzione di sistemi artificiali simili alle cellule: dall'origine della vita alla biologia sintetica.

• Esercitazione 1 e 2: Utilizzo di Excel o analoghi programmi per la modellizzazione del binding e della catalisi chimica e bio-chimica (file Excel dei dati)

• Esercitazione 3: Utilizzo di COPASI per la modellizzazione di reazioni chimiche (link alla pagina web di COPASI)

• Esercitazione 3: Determinazione sperimentale di kcat e Km per la reazione di idrolisi di un peptide cromogenico catalizzata dalla alfa-chimitripsina - mediante spettrofotometria UV-Vis (link alla pagina Sigma-Aldrich del substrato)

Slides del corso telematico a.a. 2021/22

• Slides del corso telematico AA 2021-2022 (in preparazione)

Slides del corso telematico a.a. 2020/21

• Slides del corso telematico AA 2020-2021 (link alla cartella Google-Drive)

Slides del corso telematico a.a. 2019/20

• Slides del corso telematico AA 2019-2020 (link alla cartella Google-Drive)