บทความวิจัยนี้ตรวจสอบผลกระทบที่เป็นพิษของสารกำจัดวัชพืช 2,4-D dimethylammonium ต่อ กุ้งก้ามกรามวัยอ่อน (Macrobrachium rosenbergii) โดยมุ่งเน้นไปที่การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา ชีวเคมี และเนื้อเยื่อ การศึกษาพบว่าการสัมผัสสารดังกล่าวส่งผลให้ อัตราการตายเพิ่มขึ้น โดยขึ้นอยู่กับปริมาณและความเข้มข้นที่ได้รับ อีกทั้งยังส่งผลให้ จำนวนเซลล์เม็ดเลือดลดลง และเกิด ความเสียหายต่อเซลล์เม็ดเลือด ตลอดจน เนื้อเยื่อ ในส่วนหัว ตา และช่องท้อง นอกจากนี้ยังมีการเปลี่ยนแปลงของ เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ และการยับยั้ง acetylcholinesterase (AChE) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ความเป็นพิษต่อระบบประสาท การศึกษาเน้นย้ำถึง ความเสี่ยงทางนิเวศวิทยา จากการปนเปื้อนของสารกำจัดวัชพืชนี้ และชี้ให้เห็นถึงความจำเป็นในการ ติดตามตรวจสอบ และ กำกับดูแล เพื่อปกป้องสิ่งมีชีวิตในน้ำ
สารกำจัดวัชพืช 2,4-D ไดเมทิลแอมโมเนียม (2,4-D dimethylammonium) ส่งผลกระทบต่อสุขภาพของกุ้งก้ามกรามวัยอ่อน (Macrobrachium rosenbergii) ในหลายระดับ ได้แก่ ระดับกายวิภาค ชีวเคมี และเนื้อเยื่อ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความเป็นพิษที่ขึ้นอยู่กับปริมาณสารและความเข้มข้นของสารที่ได้รับ รวมถึงระยะเวลาในการสัมผัส
ทั้ง OCT และการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อต่างยืนยันว่าการสัมผัสกับ 2,4-D dimethylammonium ก่อให้เกิด การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาอย่างมีนัยสำคัญและการทำลายโครงสร้างเนื้อเยื่อในกุ้งก้ามกรามวัยอ่อน โดยมีผลกระทบที่ขึ้นอยู่กับปริมาณและระยะเวลาที่สัมผัส โดย OCT เป็นเครื่องมือที่ไม่รุกรานที่สามารถระบุการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในส่วนต่างๆ ของร่างกายได้ ในขณะที่การวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อให้หลักฐานเชิงลึกของการเปลี่ยนแปลงระดับเซลล์และเนื้อเยื่อที่ละเอียดอ่อน โดยเฉพาะในกล้ามเนื้อ ซึ่งเสริมความเข้าใจเกี่ยวกับความเสียหายที่เกิดจากยาฆ่าแมลง
งานวิจัยนี้มุ่งเน้นไปที่ ผลกระทบของสารกำจัดวัชพืชที่มีส่วนผสมของไกลโฟเสต ต่อปลาทับทิมในระยะเริ่มต้นของชีวิต การศึกษานี้ได้สำรวจ อัตราการฟักไข่ การพัฒนาทางสัณฐานวิทยา กิจกรรมของเอนไซม์ และการแสดงออกของอะซิทิลโคลีนเอสเทอเรส (AChE) โดยใช้เทคนิค OCT และการวิเคราะห์ทางชีวเคมี ผลการวิจัยแสดงให้เห็นถึง ความผิดปกติในการพัฒนาที่ขึ้นอยู่กับปริมาณสารเคมีที่ได้รับ รวมถึงการลดลงของอัตราการฟักไข่และการแสดงออกของ AChE
งานวิจัยนี้ใช้ OCT เพื่อสังเกต ความผิดปกติในการพัฒนาอย่างมีนัยสำคัญที่ขึ้นอยู่กับปริมาณสาร (dose-dependent developmental abnormalities) ในไข่ ตัวอ่อน และลูกปลานิลที่ได้รับไกลโฟเสต
OCT เผยให้เห็นว่าไข่ในกลุ่มที่ได้รับไกลโฟเสตมีความผิดปกติของพื้นผิวและรูปร่าง1216 โดยมีพื้นผิวที่ไม่เรียบและโครงสร้างภายในที่ไม่สอดคล้องกันเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีโครงสร้างภายในที่สม่ำเสมอ
การรวม OCT เข้ากับการประเมินทางชีวเคมีและสัณฐานวิทยาแบบดั้งเดิม ช่วยให้งานวิจัยนี้สามารถเข้าใจผลกระทบของไกลโฟเสตได้อย่างลึกซึ้งยิ่งขึ้น และยังแสดงให้เห็นว่า OCT เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพและคุ้มค่าสำหรับการวิจัยด้านพิษวิทยาทางนิเวศวิทยา
ในลูกปลาในระยะเริ่มต้น ภาพ OCT แสดงให้เห็นถึงความผิดปกติอย่างชัดเจน โดยกลุ่มที่ได้รับสารมีการพัฒนาที่ล่าช้า ขนาดลำตัวเล็กลง และมีปัญหาโครงสร้างที่เห็นได้ชัด1314 โครงสร้างของหัวไม่สม่ำเสมอและพื้นผิวเรียบขึ้น14 นอกจากนี้ยังพบว่า โครงสร้างกระดูกสันหลังส่วนหลังมีการโค้งงอและผิดรูป (bent and deformed dorsal skeleton) และเซลล์ในช่องท้องส่วนล่างมีอาการบวม (swollen)
งานวิจัยนี้เป็นการศึกษาเพื่อ ประเมินผลกระทบของสารกำจัดวัชพืช 2,4-D dimethylammonium ต่อกุ้งฝอย (Riceland Prawn หรือ Macrobrachium lanchesteri) ซึ่งเป็นสารที่ใช้กันอย่างแพร่หลายและสามารถสะสมในสัตว์น้ำได้ การศึกษานี้ใช้ เทคนิค Optical Coherence Tomography (OCT) เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของกุ้งฝอย รวมถึงการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยาและกิจกรรมของเอนไซม์ต่างๆ
ความเป็นพิษของ 2,4-D dimethylammonium ต่อกุ้งฝอยเพิ่มขึ้นตามความเข้มข้นและระยะเวลาที่สัมผัส อัตราการตายสะสมของกุ้งฝอยเพิ่มขึ้นเมื่อความเข้มข้นและระยะเวลาในการสัมผัสเพิ่มขึ้น โดยค่า LC50 (ความเข้มข้นที่ทำให้กุ้ง 50% ตาย) ลดลงเมื่อระยะเวลาสัมผัสเพิ่มขึ้น
AChE ซึ่งเป็นเอนไซม์สำคัญในการส่งสัญญาณประสาทและเป็นไบโอมาร์คเกอร์สำหรับประเมินการสัมผัสสารกำจัดศัตรูพืช มีน้ำหนักโมเลกุล 71 kDa ในกุ้งฝอย การแสดงออกของ AChE มีแนวโน้มลดลงเมื่อระยะเวลาสัมผัสเพิ่มขึ้น และไม่พบการแสดงออกเลยที่ความเข้มข้น 400 และ 450 µL/L หลังจากสัมผัสสารไป 96 ชั่วโมง ระดับการแสดงออกที่ต่ำลงนี้สอดคล้องกับการศึกษาในปลานิลที่สัมผัสสาร 2,4-D dimethylammonium
เทคนิค OCT สามารถแสดงภาพสามมิติความละเอียดสูงของตัวอย่างกึ่งโปร่งใสได้อย่างรวดเร็วและไม่รุกราน ในกุ้งฝอยที่สัมผัสสาร 2,4-D dimethylammonium พบการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา เช่น ดวงตามีรูปร่างผิดปกติ การบวมของเซลล์บริเวณเหงือกใต้กระดอง เนื้อเยื่อผิดปกติและสลายตัว กล้ามเนื้อบริเวณลำตัวบวม มีรูพรุนขนาดใหญ่ ผิวภายนอกหยาบ และบริเวณแพนหาง (telson และ uropod) มีลักษณะบวม แพนหางแยกออก และเนื้อเยื่อฉีกขาด การวิเคราะห์แบบ 3 มิติด้วย OCT ยืนยันการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเนื้อเยื่อที่สำคัญในกลุ่มที่สัมผัสสารเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม
ผลการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค OCT เพื่อเปรียบเทียบความเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของกุ้งก้ามกรามน้ำจืด (Riceland prawn) ที่ได้รับสาร 2,4-D dimethylammonium ความเข้มข้น 450 µL/L เป็นเวลา 96 ชั่วโมง กับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับสาร
กลุ่มควบคุม: บริเวณตามีลักษณะเซลล์ปกติ บริเวณเหงือกที่ส่วนหัว-อกมีพื้นผิวด้านนอกปกติ บริเวณส่วนท้ายและขาว่ายน้ำส่วนท้ายมีรูปร่างปกติ
กลุ่มที่ได้รับสาร: บริเวณตามีรูปร่างบิดเบี้ยว บริเวณเหงือกที่ส่วนหัว-อกมีเซลล์บวมและเนื้อเยื่อผิดปกติ/สลายตัว ส่วนปล้องท้องมีเซลล์กล้ามเนื้อบวม มีรูพรุนขนาดใหญ่ และมีพื้นผิวด้านนอกขรุขระ ส่วนท้ายและขาว่ายน้ำส่วนท้ายมีลักษณะบวม ส่วนขาว่ายน้ำแยกออกจากกัน และเนื้อเยื่อฉีกขาด
การวิเคราะห์แบบ 3 มิติ (3D analysis) โดยใช้ข้อมูลจากเทคนิค OCT ซึ่งได้มาจากบริเวณส่วนปล้องท้องของกุ้งก้ามกรามน้ำจืด รูปนี้เปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างกุ้งในกลุ่มที่ได้รับสาร 2,4-D dimethylammonium ที่ความเข้มข้น 450 µL/L เป็นเวลา 96 ชั่วโมง กับกุ้งในกลุ่มควบคุม ในภาพประกอบด้วยภาพถ่ายกุ้ง (A และ G) ภาพ En face (B และ H) ที่ได้จากการรวมข้อมูล OCT แบบ 3 มิติทั้งหมด ซึ่งแสดงให้เห็นความแตกต่างที่ชัดเจนของลักษณะเนื้อเยื่อ นอกจากนี้ ยังมีภาพ En face ที่สร้างขึ้นใหม่จากตำแหน่งความลึกต่างๆ ในกลุ่มที่ได้รับสาร (C-1 ถึง C-5) ซึ่งแสดงลักษณะเนื้อเยื่อที่ผิดปกติ โดยมีลูกศรสีแดงชี้บอกถึงความเสียหายหรือการเปลี่ยนแปลงที่อาจเกิดขึ้น ในทางตรงกันข้าม กลุ่มควบคุม (E-1 ถึง E-5) แสดงโครงสร้างเนื้อเยื่อปกติโดยมีลูกศรสีเขียวชี้บอก ภาพตัดขวางตามความลึก (D-1 ถึง D-5 และ F-1 ถึง F-5) ยังช่วยยืนยันข้อสังเกตเหล่านี้ โดยกลุ่มที่ได้รับสารแสดงให้เห็นสัณฐานวิทยาของเนื้อเยื่อที่ผิดปกติในหลายระดับความลึก ในขณะที่กลุ่มควบคุมยังคงปกติและสม่ำเสมอ ผลลัพธ์จากรูปนี้ชี้ให้เห็นว่า การได้รับสาร 2,4-D dimethylammonium มีผลเสียต่อเนื้อเยื่อกุ้ง นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่สังเกตได้ชัดเจนผ่านการสร้างภาพ OCT แบบ 3 มิติ
การวิจัยนี้ศึกษาผลกระทบของสารกำจัดวัชพืชที่มีส่วนผสมของไกลโฟเซต (glyphosate-based herbicide) ต่อไข่และตัวอ่อนของหอยเชอรี่ (golden apple snail, Pomacea canaliculata) โดยเฉพาะอย่างยิ่งผลกระทบต่ออัตราการฟักไข่ การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา และการแสดงออกของเอนไซม์อะเซทิลโคลีนเอสเทอเรส (acetylcholinesterase, AChE) หอยเชอรี่เป็นสัตว์น้ำที่มีความสำคัญในด้านนิเวศวิทยาและเศรษฐกิจ และการสัมผัสกับสารกำจัดวัชพืชในแหล่งน้ำอาจส่งผลกระทบต่อประชากรหอยและระบบนิเวศในน้ำได้
การวิเคราะห์ภายในของตัวอ่อนหอยเชอรี่สีทองระยะตัวอ่อน (larval stage) ที่อยู่ในไข่ โดยใช้เทคนิค OCT
ภาพเหล่านี้ได้จากการนำไข่ที่ได้รับสัมผัสกับสารเคมีไกลโฟเซตที่ความเข้มข้นต่างๆ กัน (0, 2, 4, 6, 8, และ 10 มิลลิลิตรต่อลิตร) เป็นเวลา 96 ชั่วโมง มาทำการวิเคราะห์
รูปแสดงมุมมองแบบต่างๆ ได้แก่ ภาพตัดขวาง (Cross section), ภาพมุมมองด้านหน้า (En face), และภาพเรนเดอร์ 3 มิติ (3D Rendering) ของตัวอ่อน
สิ่งที่สำคัญคือ ภาพแสดงให้เห็นถึง การเปลี่ยนแปลงและสิ่งผิดปกติทางโครงสร้างภายในของตัวอ่อน (เช่น ต่อมกลางลำไส้ ไต และกล้ามเนื้อ) โดยมีลูกศรสีขาวชี้ตำแหน่งที่มีการเปลี่ยนแปลง
ผลกระทบนี้มีความเด่นชัดมากขึ้นในกลุ่มที่ได้รับไกลโฟเซตที่ความเข้มข้นสูงขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่าไกลโฟเซตส่งผลกระทบโดยตรงต่อพัฒนาการและสรีระของตัวอ่อนหอยเชอรี่สีทอง
ในงานวิจัยนี้ บทบาทของเทคนิค Optical Coherence Tomography หรือ OCT มีความสำคัญอย่างยิ่งในฐานะ เครื่องมือหลักในการประเมินการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาและโครงสร้างภายในของไข่และตัวอ่อนหอยเชอรี่สีทอง ที่สัมผัสกับสารเคมีกำจัดวัชพืชที่มีส่วนผสมของไกลโฟเซต
OCT ถูกเลือกใช้เนื่องจากเป็นเทคนิคการถ่ายภาพแบบ ไม่รุกราน (non-invasive) และไม่ทำลาย (non-destructive) ที่สามารถให้ภาพข้อมูลได้แบบ เรียลไทม์ (real-time) สำหรับการประเมินทางชีววิทยา
การใช้ OCT ในงานวิจัยนี้ช่วยให้นักวิจัยสามารถ วิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงทางโครงสร้างได้อย่างละเอียด ทั้งในรูปแบบภาพตัดขวาง (cross-section) ภาพฉายหน้าตรง (en face) และการสร้างภาพ 3 มิติ (3D rendering) ทำให้มองเห็นโครงสร้างภายในและภายนอกได้อย่างชัดเจน
จากการวิเคราะห์ด้วย OCT ไข่หอยเชอรี่สีทองที่สัมผัสกับไกลโฟเซตแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่ชัดเจน เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม โดยพบว่ามีการบิดเบี้ยวของรูปร่าง การเกิดรอยแตกหรือความแห้ง ซึ่งความรุนแรงของการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ เพิ่มขึ้นตามความเข้มข้นของไกลโฟเซต ที่เพิ่มสูงขึ้น
นอกจากไข่แล้ว OCT ยังเผยให้เห็นถึง ความผิดปกติทางสัณฐานวิทยาในตัวอ่อนหอยเชอรี่ ที่สัมผัสกับสารเคมีดังกล่าว ตัวอ่อนมีรูปร่างที่ผิดปกติและมีการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ก็มีความสัมพันธ์โดยตรงกับความเข้มข้นของไกลโฟเซตเช่นเดียวกัน
อัตราการฟักไข่และอัตราการรอดชีวิตของตัวอ่อนหอยเชอรี่ลดลงเมื่อสัมผัสกับไกลโฟเซตในความเข้มข้นที่สูงขึ้น
พบการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่ผิดปกติในไข่และตัวอ่อนที่สัมผัสกับไกลโฟเซต รวมถึงไข่ที่ผิดปกติ ตัวอ่อนที่มีความผิดปกติ และเนื้อเยื่อที่เสียหายหรือเนื้อเยื่อเชื่อมต่อกัน ความผิดปกติที่พบมีความรุนแรงมากขึ้นตามความเข้มข้นของไกลโฟเซตที่เพิ่มขึ้น
การแสดงออกyของเอนไซม์ AChE ลดลงเมื่อความเข้มข้นของไกลโฟเซตเพิ่มขึ้น โดยพบการลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการสัมผัสที่ 24, 48, 72 และ 96 ชั่วโมง
ความละเอียดทางสเปกตรัมยังผล (effective spectral resolution) ของสเปกโทรมิเตอร์ที่ใช้อุปกรณ์การกระจายแสง (dispersive optics) มักจะถูกจำกัดด้วยขนาดของพิกเซลตัวรับรู้ (sensor pixels) หรือความละเอียดทางแสง (optical resolution) ของเลนส์รวมแสง (focusing optics) ดังนั้น การจัดตำแหน่งทางแสง (optical alignment) ให้เหมาะสมที่สุดจึงมีความสำคัญอย่างยิ่งเพื่อให้ได้ความละเอียดทางสเปกตรัมยังผลของสเปกโทรมิเตอร์สูงสุด
ในบทความนี้ เรานำเสนอวิธีการในห้องปฏิบัติการสำหรับการประเมินการจัดตำแหน่งของสเปกโทรมิเตอร์แบบเวลาจริง (real-time assessment) โดยการวัดฟังก์ชันถ่ายโอนการมอดูเลต (Modulation Transfer Function: MTF) การมอดูเลตบนสัญญาณสเปกตรัมถูกสร้างขึ้นโดยใช้อินเทอร์เฟอโรมิเตอร์ (interferometer) ซึ่งช่วยให้สามารถควบคุมความถี่การมอดูเลตได้โดยการปรับผลต่างระยะทางแสง (optical path difference)
ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าเทคนิคที่นำเสนอนี้สามารถให้ข้อมูลที่เป็นประโยชน์เกี่ยวกับการจัดตำแหน่งของสเปกโทรมิเตอร์ ซึ่งสามารถนำไปใช้เพื่อให้ได้การจัดตำแหน่งสเปกโทรมิเตอร์ที่เหมาะสมที่สุด ความแม่นยำของวิธีการที่นำเสนอนี้ได้รับการยืนยันโดยการเปรียบเทียบผลการวัด MTF และการประเมินความละเอียดที่ได้ กับคุณลักษณะเฉพาะ (specifications) ของสเปกโทรมิเตอร์ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ นอกจากนี้ เรายังสาธิตกรณีการใช้งานของวิธีการที่นำเสนอนี้โดยทำการวัด MTF ตลอดช่วงโฟกัส (through-focus MTF measurement) บนสเปกโทรมิเตอร์ที่สร้างขึ้นเอง (custom-built) ซึ่งทราบค่าการจัดตำแหน่งที่คลาดเคลื่อน (known misalignments)
ตั้งแต่ปี พ.ศ. 2558 เราได้พัฒนาต้นแบบกล้องจุลทรรศน์โอซีที (OCT) ขนาดกะทัดรัดอย่างต่อเนื่อง ซึ่งออกแบบมาโดยเฉพาะสำหรับการประเมินภาคสนามในการศึกษาสัตว์น้ำ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กล้องนี้ถูกใช้เพื่อประเมินการสัมผัสสารเคมีกำจัดศัตรูพืชในปลาน้ำจืด เครื่องต้นแบบนี้ประกอบด้วยชิ้นส่วนทางแสงที่มีจำหน่ายทั่วไปทั้งหมด สามารถสร้างภาพได้ลึกถึง 2 มิลลิเมตรจากพื้นผิวตัวอย่าง ด้วยอัตราเร็ว 20 เฟรมต่อวินาที และมีความละเอียดในการถ่ายภาพ 10 ไมโครเมตรทั้งในแนวระนาบและแนวลึก เราได้สาธิตประโยชน์ของเครื่องมือนี้โดยการถ่ายภาพปลาดุกแอฟริกันที่สัมผัสกับสารเคมีกำจัดวัชพืช 2,4-ดี ไดเมทิลแอมโมเนียม และเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม เราทำการถ่ายภาพสามมิติในสิ่งมีชีวิต (in vivo) โดยใช้เครื่องต้นแบบที่พัฒนาขึ้นนี้กับปลาดุกแต่ละตัวตลอดระยะเวลาการฟักตัวและการเจริญของตัวอ่อน เพื่อเปรียบเทียบกลุ่มที่สัมผัสสาร 2,4-ดี กับกลุ่มควบคุม ผลการศึกษาแสดงให้เห็นความเบี่ยงเบนอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่สัมผัสสารดังกล่าวจากรูปแบบการพัฒนาตามปกติที่สังเกตได้ในกลุ่มควบคุม สิ่งนี้เป็นการยืนยันความสามารถของโอซีทีในการประเมินผลกระทบของสารเคมีกำจัดวัชพืชต่อสิ่งมีชีวิตในน้ำ