L’apparition ou la variation de couleur (au sens le plus large du spectre : visible, UV et aussi de fluorescence) est très utilisée en physiologie. La spectrophoto- ou fluori- métrie permet de quantifier un grand nombre de composés cellulaires et aussi de mesurer des activités enzymatiques, le plus souvent grace à des "colorants" spécifiques. Mais l’expérimentateur doit maitriser quelques principes de base de la spectrophotométrie (si besoin voir le lien wikipédia) et de l’utilisation d’une courbe d’étalonnage !

Ces données serviront aussi d’illustration quant au problème de la précision des mesures et des résultats calculés.

Exo-1** Exemple de Courbe d’Étalonnage pour le dosage des protéines.

• Principe => Afin de déterminer la concentration en protéine d'une solution inconnue (broyat de cellules par exemple), on utilise un réactif dit de "Bradford", qui produit une couleur bleue d'autant plus intense que les protéines sont concentrées. Le spectrophotomètre quantifie cette "intensité de bleu" en mesurant l'absorbance (ou DO pour densité optique) de la solution à la longueur d'onde d’absorption maximale (ici 595 nm).
• Gamme d'étalonnage =>Dans une 1^ère série de tubes, une solution mère d'une protéine dite de référence (telle que l'albumine) est diluée en série pour obtenir une gamme de concentration croissante (par exemple de 0 à 20 mg/ml). Après ajout du réactif (par exemple 200 µl de réactif pour 1 ml de solution), les DO des tubes sont lues par le spectrophotomètre, permettant de tracer la courbe d'étalonnage comme ci-dessous.

Félicitation : vous êtes arrivé/e à la fin des exercices concernant la spectrophotométrie, gamme étalon et précision des résultats.