결막 술잔세포는 술잔모양의 상대적으로 큰 세포이고 뮤신을 분비하여 안구 표면 보호막인 눈물막의 뮤신층 형성에 기여합니다. 다원성 안구건조증은 눈물막의 이상으로 발생하는 데, 결막 술잔세포 이상은 뮤신층 부족으로 눈물막이 불안정해 져서 안구건조증을 유발합니다. 이 이외에도 안구건조증은 눈물막을 구성하는 수성층과 지질층 부족으로도 발생합니다. 결막 술잔세포는 안구건조증 이외에 감염 등 여러 안구 표면질환의 원인 또는 중증도를 보여 주므로 이를 검사하는 것은 유용합니다.

결막 술잔세포는 안구 표면에 있어서 접근이 가능하고 잘 영상화 하면 사람 눈에서도 영상화 할 수 있습니다. 우리는 여기서 고대비도 영상화 방법과 실제 사람에서 영상화 하기 위한 고성능 현미경을 개발하고 있습니다.

결막 술잔세포를 어떻게 잘 보이게 하지?

안구 표면에 있는 결막 술잔세포를 어떻게 고해상도로 촬영하지?

현재 살아있는 토끼에서도 그리고 사람에서도 결막 술잔세포를 선명하게 촬영할 수 있게 되었습니다.

사람에서 현미경 세포 영상을 통해 병변을 진단하는 것은 공상과학소설 같은 이야기 인데, 오랫동안 노력하다 보니 많은 발전을 이룬 것 같습니다. 향후 임상연구를 통해 안구 표면질환에서 술잔세포 검사의 유용성을 검증해서 많이 활용될 수 있도록 노력하겠습니다.

다음번에는 현미경을 활용한 정밀 암 수술 가이드에 대해 소개하겠습니다.

미래 기계공학

기계공학은 물리학을 바탕으로 물체의 동적 거동에 대한 분석 및 해석, 그리고 제조 및 가공을 통한 대량생산 기술을 연구합니다.

특히 기계공학의 대량생산 기술은 지난 산업혁명 이후 인류 문명 발전에 많은 기여를 해 왔습니다. 그렇다면 역설적으로 산업혁명기를 지나고 현재의 정보혁명기에서는 기계공학은 덜 중요할까요? 기계공학은 그동안 마이크로 나노 스케일 제조 기술, 3차원 프린팅과 같은 적층 제조기술, 그리고 정밀 측정 기술 등의 개발을 주도하여 정보혁명에 필수적인 소형 스마트 기기 개발에 기여해 왔습니다. 그리고 물리 현상에 대한 컴퓨테이션 모델링 기술을 활용하여 동력을 만드는 장비의 효율을 높이는 데 사용되어 왔으며, 최근에는 태풍과 같은 거대한 자연현상에 대한 해석 기술로도 활용되고 있습니다.

미래 에너지를 비롯하여 에너지 생산, 활용 등에도 큰 기여를 하여 정보혁명에 기여하고 정보혁명으로 더 발전할 것으로 기대합니다.

기계공학자가 현미경학자?

네 저는 기계공학 박사이며 현미경학자 입니다. 좀 독특하죠? 학부에서는 고체역학, 동역학, 제어를 좋아 했으며 석사학위로 고체역학 중 탄성학과 제어가 합쳐진 새로운 구조의 액츄에이터를 연구했고, 박사학위를 위해 유학길을 떠나 새로운 학문에 도전하다가 현미경학의 길에 들어서서 이미 25년이 되었고 즐겁게 연구개발 하고 있습니다.

현미경학자의 전공을 보면 참 다양합니다. 물리학, 전자공학, 기계공학, 화학, 생물학 등등. 기계공학자가 만드는 현미경은 좀 독특합니다. 고속 고성능 현미경을 만드는데, 고체역학을 고려한 구조, 진동을 최소화 하면서 고속으로 구동시키기 위한 제어와 액츄에이터 사용이 독특하고, 결국 시스템을 설계하고 제작합니다. 이는 물리학자이나 전자공학자가 접근하는 방식과는 좀 다르죠. 제 생각에 기계공학자가 만드는 장비가 좀 더 멋있다고 생각합니다. 움직이는 게 많아서.

현미경은 종합 또는 토털 학문입니다. 영어로는 interdisciplinary field 입니다. 또한 생물학의 발전과 의학의 요구로 많은 발전을 이루고 있고, 반도체 공정에 많은 기여를 하고 있으며, 마이크로 나노 세계를 들어가는 창 입니다.

현미경학자인 저는 이것 저것에 관심이 많고 아이디어를 얻기 위해 많은 전문가 분들을 만나고 다닙니다. 공부 할때는 광학을 배우느라 어려웠고, 적용분야가 생물학 의학이다 보니 이것을을 공부하느라 맨땅에 헤딩도 많이 했습니다. 그런데 연구를 계속하면서 전문가들 분에게 배우고, 저 자신도 전문가가 되니 공부가 점차 재미있어 졌습니다. 그래서 더 많은 관심사가 생깁니다. 요즘에는 인공지능을 비롯한 연산기술을 배우고 적용해서 좋은 데이터를 만들고, 좋은 시스템을 만들고 있습니다. 저는 현미경학자라는 게 좋습니다. 매일이 새롭네요.

Optics and Microscopy in Korean

현미경 학자로서 현미경 기술과 응용 세계에 대해 소소하게 적어 봅니다.

광학 그리고 광학 현미경의 원리에 관한 내용 입니다.

읽어 보시다가 질문이 있으면 이메일로 알려주세요. 공학박사 김기현. kiheankim at postech.ac.kr

광학 현미경은 무엇이며 왜 중요한가

빛을 활용하여 마이크론 크기의 사물을 확대해서 맨눈이나 카메라로 관찰을 가능하게 하는 영상 기기

수십배 또는 100배 까지 확대할 수 있어 수 마이크론 크기의 세포 등을 맨눈으로 관찰할 수 있음

고배율로 확대했을 때 상세한 구조들이 잘 보이는 것 (고해상도)이 중요한데, 광학 현미경은 빛을 매개체로 사용하기 때문에 고해상도 영상화가 가능함. 이는 빛의 파장이 서브 마이크론 단위로 짧기 때문이며 (가시광의 경우 0.5 마이크론 대), 상대적으로 큰 세포 (약 10 마이크론 크기) 등은 선명하게 관찰할 수 있음

마이크로 세상을 볼 수 있게 하는 장치여서 생물학, 의학, 재료 등 다양한 분야에 사용됨

광학 현미경의 구성은?

여러 렌즈들의 조합으로 구성되어 있어 고 배율로 확대할 수 있음 (약 10배 ~100배). 대물렌즈 (objective lens), 튜브렌즈 (tube lens), 그리고 접안렌즈 (eyepiece lens) 등.

배율을 높이기 위한 방법은 확대경이 있는데, 확대경 렌즈 하나로는 약 5배 정도 확대된 이미지 만을 얻을 수 있음. 광학 현미경에서는 더 높은 배율이 요구되며 렌즈들의 조합으로 구현할 수 있음

대물렌즈 (objective lens)는 관찰하려는 사물에 가까이 붙여 사물에서나오는 빛을 집속하며, 튜브렌즈 (tube lens)는 대물렌즈로 집속한 빛으로 확대 이미지를 형성함. 대물렌즈와 튜브렌즈는 렌즈여서 빛을 굴절 시키는데 대물렌즈는 사물에서 발산하는 빛을 굴절시켜 평행광을 만들고 튜브렌즈는 평행광을 굴절시켜 한 초점에 모이게 함. 대물렌즈와 튜브렌즈의 조합으로 최대 약 100배까지의 확대 영상을 획득할 수 있음 (카메라를 이미지가 형성되는 면에 위치했을 때).

확대 비율은 대물렌즈와 튜브렌즈의 초점거리 비율로 결정되는데, 100배 확대를 위해서는 튜브렌즈가 200 mm 일 때 대물렌즈의 초점거리는 2mm 이어야 함. 대물렌즈는 정말 사물에 가까이 붙이게 됨

접안렌즈는 대물렌즈와 튜브렌즈로 확대된 이미지를 눈으로 보기 위하여 사용함. 접안렌즈는 맨눈 보다 확대해서 보기위한 확대경 렌즈와 유사한 역할을 함. 접안렌즈는 eyepiece lens이며 이는 눈에 갖다 붙이기 때문임. 접안렌즈는 튜브렌즈에 의해 초점이 모였다가 다시 발산하는 빛을 받아 굴절시켜 눈으로 전달함. 눈은 들어오는 빛을 전안부에서 굴절시켜 후안부에 있는 망막에서 초점이 맺히게 함. 접안렌즈는 사물이 약 25센티미터 떨어져 있는 곳에 보이게 함

렌즈의 기능?

렌즈는 평행광을 받아서 굴절 시켜서 한 점에 모을 수 있음. 태양광을 모아 초점을 만드는 경험을 한 적이 있을 텐데, 태양은 멀리 있으므로 렌즈에 도달하는 빛은 평행광으로 간주할 수 있음. 렌즈는 평행광 ray 각각을 굴절 시켜 한 점에 모이게 하는데 렌즈 가장자리를 지나는 빛 ray는 더 많이 굴절시켜서 초점을 형성함. 이는 렌즈가 구와 같은 곡면을 가지고 있기 때문임. 초점의 위치는 렌즈의 굴절 파워에 따라 달라짐. 굴절 파워가 크면 초점은 짧아 짐

초점에서 시작된 빛의 ray 들은 발산하다가 렌즈를 지나면 평행광이 됨. 이도 역시 렌즈가 발산하는 빛 ray 들을 굴절시켰기 때문임

이렇게 렌즈는 사물에서 나오는 빛을 굴절시켜 이미지를 만들 수 있음. 사물의 각 포인트에서 출발하는 빛은 발산함. 렌즈는 이 빛 (ray)들을 굴절시키고 이들을 다시 한 점에 모이게 할 수 있으며 그 위치에서 사물의 복사본인 이미지가 형성됨. 빛이 모이는 위치에 카메라를 두면 사물의 이미지를 획득할 수 있음

이미지가 형성되는 위치는 렌즈의 초점거리와 사물의 위치에 따라 결정되며 이에 따라 이미지의 배율도 결정됨. 사물의 렌즈부터의 거리를 a, 렌즈의 초점거리를 f 라 하면 이미지의 위치 b 는 1/a + 1/b = 1/f 관계식으로 구할 수 있음. 배율은 이미지의 크기와 사물의 크기 비율인데 이는 이미지의 거리와 사물 거리 비와 같음 M = b/a

현미경에서 각 렌즈의 역할은?

대물렌즈는 시료에 가까이 붙이는 렌즈로 시료를 렌즈의 초점거리에 두고 시료에서 출발한 발산하는 빛을 집속하고 굴절시켜 평행광을 만듦

튜브렌즈는 대물렌즈에서 전달되는 평행광을 받아 렌즈의 초점 위치에 이미지를 형성함

현미경의 배율은 대물렌즈의 초점거리와 튜브렌즈의 초점거리 비율로 결정됨 (M = f_tube/ f_objective)

접안렌즈는 튜브렌즈 초점위치를 통과해서 다시 발산하는 빛을 받아서 굴절시켜 거의 평행광으로 만들어 눈에 전달함. 눈은 평행광을 받아 굴절시켜 안구 망막에 이미지를 형성함. 더 정확히 말하면 눈은 사물이 25cm (250mm) 앞에 위치하는 것으로 봄 (평행광 보다는 약간 발산하는 빛으로 안구에서 받아들임으로서)

눈의 기능

눈은 사물을 볼 수 있도록 광학계가 구성되어 있음. 전면부에 투명한 각막과 수정체 렌즈가 렌즈의 역할을, 그리고 후면부의 시신경의 망막이 카메라 역할을 함. 보고자 하는 사물에서 출발한 빛은 각막과 렌즈에 의해 굴절되고 망막에서 초점 또는 이미지가 만들어져 시신경이 감지함.

각막은 곡면이고 조직과 물로 차 있어서 고정적으로 빛을 굴절시키는 역할을 하며, 수정체 렌즈는 근육조직과 연결되어 있으며 근육조직의 수축과 이완이 곡률을 조절하여 가까이 있는 사물과 멀리 있는 사물 둘 다 망막에 초점이 맺히게 함. 각막과 수정체 렌즈 조합이 초점거리를 조절할 수 있는 액티브 렌즈 역할을 함

망막은 광수용체 세포와 신경세포들로 구성되어 있음. 광수용체 세포가 가시광 파장 (또는 에너지)를 감지하고 액션포텐셜을 발생시키며 이들 신호를 프로세싱하는 신경세포 들이 있고 최종적으로는 다발로 만들어져 뇌와 연결됨. 광수용체 세포는 cone 모양의 세포와 rod 모양의 세포가 있으며, 각각 컬러 그리고 민감한 감지 역할을 함. 이들은 밀집해서 분포하지만 그래도 카메라의 화소 수에 비해 많이 부족함. 그럼에도 불구하고 선명한 이미지를 얻을 수 있는 이유는 눈이 계속 움직여서 화소 수를 늘리고 망막 신경세포들의 프로세싱 덕분인 것으로 알려짐

눈은 렌즈의 초점 조절을 통해 먼 곳과 가까운 곳에 있는 사물을 볼 수 있는데, 가장 가까이서 확대해서 볼 수 있는 거리는 25센티미터 임. 이는 책을 읽을 때 책을 두는 거리임. 사물을 더 가까이 당겨오면 눈은 굴절파워가 충분치 못해 초점을 맺지 못함. 그러므로 안구의 크기가 지름이 약 25밀리미터 임을 고려하면 안구의 확대비율은 0.1 배로 de-magnification 하는 시스템 임. 이는 넓은 곳을 보기 위한 최적의 방법임

맨눈으로는 25센티미터까지 사물을 볼 수 있는데 그 보다 더 확대해서 보려면 확대경 또는 접안렌즈를 사용해야 함. 확대경은 사물의 각 포인트에서 출발한 빛을 한번 굴절시켜 눈에 들어가게 하므로 사물을 눈에 더 근접시킬 수 있으며 확대 비율이 늘어남. 접안렌즈의 경우 초점거리가 약 25밀리미터로 맨눈 (초점거리 250밀리미터) 보다 약 10배 확대할 수 있어 최종적인 확대비율은 약 1배가 됨

eyepiece 렌즈 또는 접안 렌즈는 튜브렌즈에 의해 형성된 이미지 면을 지나서 다시 발산하는 빛을 굴절 시켜 거의 평행하게 만들고 눈이 이 빛 ray를 받아서 보면 마치 사물이 25센티미터 위치에 있는 것으로 인식함. 접안렌즈의 초점거리가 25밀리미터로 접안렌즈와 안구의 각막/수정체 렌즈에 의한 이미지 릴레이 배율은 1배 가 됨 (원래 배율은 1/10 임. 25센티미터 사물, 굴절후 약 25밀리미터에 상이 맺히므로)

기하광학을 이용한 이미지 구성 (geometrical optics)

기하광학은 빛이 직진하는 성질을 사용해서 빛이 모이고 발산하는 것을 설명하는 방법임

평행광이 렌즈를 통과하면 렌즈의 초점에 모였다가 퍼지는 것도 기하광학으로 설명하는 것임

빛의 진행방향을 추적하는 것을 ray tracing 이라고 하는데, 렌즈에 대한 3가지 ray 에 대해서는 쉽게 tracing을 할 수 있음. (1) 렌즈의 front focal point를 통과하는 ray는 렌즈에서 굴절되고 나면 광축에 평행한 평행광이 됨, (2) 렌즈의 center를 지나는 ray는 굴절하지 않고 직진함, (3) 광축에 평행하게 입사하는 ray는 back focal point를 통과함

위의 세가지 ray를 trace 하면 이미지가 형성되는 위치를 알 수 있으며 이미지의 배율도 계산할 수 있음

예전 현미경 구조와 현대 현미경 구조의 차이

예전 현미경에서는 대물렌즈 하나로 확대 이미지를 만드는 데 비해 현대 현미경에서는 대물렌즈와 튜브렌즈 조합으로 확대 이미지를 만듦.

대물렌즈는 사물에서 발산하는 빛을 집속하고 굴절시켜 평행광을 만들고 튜브렌즈는 평행광을 받아 굴절시켜 초점거리 위치에 확대 이미지를 만듦. 이 경우 대물렌즈와 튜브렌즈 사이 거리는 아주 정확할 필요가 없음. 평행광으로 전달되므로 거리가 조금 달라져도 이미지 형성에는 문제가 없음

그러므로 대물렌즈와 튜브렌즈 사이에 이색거울 등 광학 소자들을 포함시킬 수 있게 됨 (형광 현미경에서 주로 사용)

Field of view (FOV)

FOV는 현미경으로 관찰 가능한 시료에서의 영역을 의미 하며 현미경의 배율에 따라 달라짐

대물렌즈와 튜브렌즈의 조합으로 만들어 지는 이미징 면에 카메라를 위치시켜 촬영 하는데, 카메라 소자의 크기를 배율로 나눈 것이 사물에서의 FOV가 됨. 여기서는 카메라 소자의 크기가 FOV를 결정하는 limiting factor 임

일반적으로 현미경에서 사용하는 카메라는 13.3 mm x 13.3 mm 가로 x 세로 (18mm diagonal, 1" 카메라) 이고 10x 배율인 경우 FOV는 1.3 mm x 1.3 mm 가 됨

렌즈메이커가 사용했던 공식

렌즈메이커 공식은 렌즈 굴절 파워 (세기)를 구하는 방법을 간단한 수식으로 표현한 것임

굴절 파워는 평행광을 입사했을 때 굴절에 의해 발생하는 초점거리의 역수 임 (P = 1/f)

굴절 파워는 렌즈 매질의 굴절율 (n)이 높을 수록 그리고 렌즈 양면의 곡률 (1/R)이 클 수록 높아짐. 구체적으로는 렌즈 굴절율과 주변 공기 굴절율의 차이 (n-1), 그리고 양면의 곡률의 합 (1/R1, 1/R2)의 곱셈이 됨:

P = (n-1)*(1/R1-1/R2)

이는 공기중에서 렌즈가 동작한다는 가정이고 곡률의 정의로 양쪽이 볼록면일 지라도 한쪽의 곡률은 음수가 되므로 더하기 위해서는 곡률을 빼는 형태가 되는 것임

여기서는 렌즈의 이상적인 곡면이 spherical 한 것으로 가정하였음. 실제는 아니며 spherical lens는 spherical aberration 이라는 수차를 유발함. 렌즈의 가장자리로 입사한 평행광이 너무 굴절되어 초점이 흐트러 지는 현상. 그러므로 렌즈 가장자리는 곡률을 완화할 필요가 있음. 이렇게 비구면 곡면을 가지는 렌즈를 aspherical lens 라고 함

실제로 구면 곡면을 가지는 렌즈가 많이 사용되고 있음. 제작에 필요한 비용이 적게 드므로. 대신 렌즈 곡면 중 광축에 가까운 부위만 사용해서 구면수차를 최소화 함

기하광학과 파동광학 (geometrical optics vs. wave optics)

기하광학에서는 빛이 직진한다고 가정 했지만 사실은 빛은 전자기파인 파동 (wave)임. wave 에는 음파, 물결파 등이 있음. 우리가 빛이 파동인 것을 못 보는 이유는 빛의 파장이 0.5 마이크론으로 매우 짧기 때문임. 대부분의 사물은 빛의 파장보다 훨씬 커서 파동 특성을 관찰하지 못하고 ray로 직진하는 것으로 보임.

하지만 초점에서는 초점 크기가 충분히 작아지게 되고 이때는 파동 특성을 고려해야 함. 초점에서 빛의 세기가 최고인 이유는 wave 들이 in phase 로 중첩되며 크기가 커졌기 때문임. 초점에서 벗어난 위치에서는 wave 들의 위상이 서로 다르고 중첩했을 때 크기가 낮아짐. 그러므로 초점은 크기가 유한한 point spread function을 이룸

굴절 현상 및 굴절의 법칙

빛이 굴절율이 다른 매질로 입사하는 경우 굴절하여 진행방향이 바뀜. 빛이 굴절하는 원인은 빛의 속도가 매질에 따라 변하기 때문임. 굴절율의 정의는 매질 내 빛의 속도로 v = c/n 이며 굴절율을 알면 매질 내 빛의 속도를 알 수 있음

빛이 통과하는 투명한 매질은 공기, 물, 유리, 오일 등이 있으며 공기의 굴절율은 진공과 같아서 n=1, 물의 경우는 n = 1.33 으로 빛의 속도가 감소함 (v = c/1.33). 유리와 오일에서는 n = 1.5 로, 빛의 속도가 더욱 감소함 (v = c/1.5)

빛의 속도 변화는 파장 변화를 의미함. 빛은 wave 여서 wave의 속도 계산식 v = lamda * freq 을 따르는데 주파수는 일정하므로 파장이 변화함. 즉 진공 대기속에 비해 물, 유리, 오일 등에서 빛의 파장이 짧아짐

매질 내 평행광이 진행하는 경우, 평행광의 파면 (wave front)이 직선이 됨. 파장은 파면 간의 간격임. 평행광이 두개 다른 굴절율을 가지는 매질의 경계면을 통과하면, 파장이 변화하므로 파면 간격도 바뀜. 이런 파면 간격 변화에 의해 굴절하여 빛의 진행방향이 바뀜

굴절 법칙은 빛이 굴절율이 다른 매질을 지나갈 때 발생하는 굴절현상을 설명하는 공식으로 n1*sin(theta1) = n2*sin(theta2) 임. 여기서 n1, n2 는 매질의 굴절율. 그리고 theta1과 theta2는 입사각, 굴절각이며, 매질 경계면의 수직선과 빛 ray가 이루는 각임. 굴절각은 입사각과 매질의 굴절율 비율에 의해 결정됨

굴절 법칙을 활용한 렌즈의 기능 설명

렌즈는 평행광을 굴절시켜 한 점(초점)에 모이게 함. 이를 구현하기 위해서는 평행광의 위치에 따라 굴절을 다르게 해야 함. 렌즈의 가장자리를 지나가는 빛이 더 많이 굴절하도록

굴절은 굴절 법칙을 따름. 굴절 법칙은 굴절각은 입사각과 굴절율의 비율로 결정된 다는 것으로 굴절을 달리 하기 위해서는 입사각을 바꾸면 됨. 렌즈 가장자리로 갈 수록 입사각이 커지게 되어야 하며, 최종적으로 곡면이 되어야 함

렌즈의 한쪽만 곡면이 되어도 렌즈 역할을 하지만, 양쪽다 곡면인 경우 굴절파워가 높아질 것임

렌즈 곡면의 방향에 따라 평행광을 집속할 수도 있고 발산 시킬 수도 있음

직립 현미경과 도립 현미경

직립 현미경 (upright microscope)와 도립 현미경 (inverted microscope)는 대물렌즈가 접근하는 방향에 따른 분류임

도립 현미경은 사물의 밑면을 아래서 바라보는 형태로 배양세포 관찰에 유용함. 왜냐하면 세포는 배양용기 바닥에 자라고 있어서 배양용기 바닥면 또는 바닥에 있는 커버슬립을 통해 관찰하여 배양세포 또는 배양액과 접촉하지 않고 감염의 위험이 없기 때문임

직립 현미경은 사물의 윗면을 위에서 바라보는 형태로 인비보 동물모델 연구에 유용할 수 있음. 샘플 고정 등을 고려해서 적합한 구조를 선택할 수 있음

현미경에서의 조명

고대비도 고해상도 현미경 영상을 얻기 위해서는 밝고 고른 조명이 필요함. 구체적으로 시료의 FOV를 일정하게 uniform intensity 로 조명하는 것임

Uniform 조명을 만들기 위해서는 렌즈를 사용함. 조명 광원이 할로겐 램프인 경우 렌즈를 사용해서 할로겐 램프 필라멘트 각 포인트에서 발산하는 빛을 모으고 평행광을 만들어 시료를 이 평행광으로 조명하는 것이 좋음. 시료를 렌즈의 초점면에 위치시키면, 각 포인트에서 출발한 발산광이 평행광이 된 상태로 시료를 비추게 되며, 위치가 다른 필라멘트 포인트에서 출발한 빛은 다른 각도로 시료에 입사하여 비추게 됨.

필라멘트에서 발생하는 빛을 수집하는 렌즈로 만들어진 평행광 면은 이의 크기가 렌즈 aperture size에 의해 제한되고 시료의 FOV보다는 훨씬 큼. 그러므로 평행광 면의 크기를 축소하기 위하여 추가적인 렌즈 한 쌍을 사용함. 초점 거리가 다른 한 쌍의 렌즈 (f1, f2) 로 4f 이미징 시스템을 만들면 렌즈 초첨거리 비율 (f2/f1) 만큼 축소 시킬 수 있음. 평행광 면을 축소시켜 대부분의 광량이 FOV를 통과하게 함

최종적으로 3개의 렌즈를 사용하면 uniform 하면서 시료의 FOV 만 비추는 intense 조명을 만들 수 있으며 이를 Koehler illumination이라 함

위의 조명 방법은 할로겐 램프 기준으로 설명한 것이며, LED를 사용하는 경우 조명 구조가 좀 더 단순화 될 수 있음

조명면과 영상면

현대 현미경 구조에서는 촬영하고자 하는 시료가 대물렌즈의 초점면에 위치하여 시료에서 발산하는 빛을 대물렌즈가 모으고 평행광으로 튜브렌즈에 전달하며, 튜브렌즈는 이 평행광을 받아서 집속해서 이미지 면을 형성함. 이런 식으로 발산, 평행, 집속 후 발산을 반복하는 형태 임.

조명의 경우 조명 필라멘트에서 발산하는 빛을 렌즈가 받아서 평행광을 만들어 시료를 조명하는 형태이고, 조명광이 시료의 위치에서는 평행광이며 시료의 빛은 발산함, 대물렌즈를 지나서 시료의 빛이 평행광이 되는 면에서는 조명광은 초점이 맺혀 필라멘트 이미지가 형성되며, 튜브렌즈를 지나 시료의 빛이 초점이 맺혀 이미지가 되는 면에서 조명광은 다시 평행광이 됨. 그래서 조명광의 이미지 면과 시료의 이미지 면은 서로 어긋나게 됨

빛은 무엇?

빛은 매우 높은 주파수를 가지는 전자기파 (electromagnetic wave)이며 그러므로 파동의 성질을 가짐

전자기파는 전기장 (electric field)과 자기장 (magnetic field)의 상호 생성작용으로 매질 없이 전파하는 (우주, 진공에서도) 에너지 전파 방법임

전자기파는 우리가 일상적으로 무선통신에 사용하는데 이들의 주파수는 100 MHz 에서 5 GHz 정도이며 안테나에 AC를 걸어서 발생시킬 수 있고 안테나로 수신할 수도 있음

빛의 주파수는 약 600 THz로 (가시광 0.5 마이크론 파장 기준) 높아 전자장비로 발생시킬 수도 없고 빛 wave 흐름을 감지할 수도 없음. 참고로 전자 장비로 만들 수 있는 radio wave는 100 MHz , 휴대전화서 사용하는 micro wave 는 수 GHz 로 가시광의 주파수 보다 훨씬 낮음. 그리고 최근 연구가 많이 되는 테라헤르츠 영상법은 1 THz 영역을 사용하는 방법으로 분자의 진동에 대응됨

초고주파수 가시광 wave 를 만드는 방법은 특이한데, 필라멘트를 높은 온도로 가열해서 전자 등의 진동으로 만들어 낼 수 있고 (백열등, 할로겐등), 전자총으로 기체분자를 들뜨게 해서 (아크 램프), 그리고 최근 적절한 에너지 밴드갭을 갖고 있는 반도체 소자 (발광 다이오드, light emitting diode (LED), 레이저 다이오드)로 전기에너지를 빛에너지로 변환하여 만들 수 있음

여기서 말하는 light wave는 일반적으로 전자기파의 electric field wave를 의미함. 카메라 등 광센서가 감지하는 것은 wave 가 전달하는 에너지 (energy 또는 intensity) 이므로 wave 를 제곱하고 시간에서 평균해서 구할 수 있음. 그래서 light의 intensity 는 wave의 amplitude를 제곱한 값에 대응됨. 같은 크기를 가지는 두개의 light wave가 보강간섭 하면 intensity가 4배가 되고 상쇠간섭하면 intensity 가 0이 됨.

가시광 wave는 주파수가 높아서 파장이 짧음. 0.4 마이크론 (청색광)-0.7 마이크론 (적색광). c = lamda * freq

파장이 매우 짧다는 것은 빛에 대한 관찰이 어려운 이유임. 파장이 너무 짧아 wave로 인지되지 않고 그냥 직진하는 ray 로 보임. 하지만 간섭현상 등으로 빛이 wave 임을 증명해 냈음.

빛은 사물의 원자 분자와 상호작용할 때는 광자 (photon)라는 에너지 단위로 흡수, 방출 됨.

빛을 수학적으로 표현하는 방법은?

사인함수로 표현할 수 있음. cos(kx-wt). 여기서 k는 공간주파수 개념 (wave number)으로 파장의 역수 (2pi/lamda), w 는 시간주파수 개념으로 2pi*freq 가 됨. 물론 공간주파수 k 와 시간주파수 w 는 빛의 속도 c 와 관계함. 일정한 속도 c 로 움직이는 wave 는 x-ct 관계를 가져여 하므로 c = w/k가 됨

빛은 사인함수뿐만 아니라 사인함수를 포함하는 복소함수로도 나타낼 수 있음. cos(kx-wt) 대신에 exp(i*(kx-wt)) = exp(i*kx)*exp(-i*wt) 로 표현할 수 있음. 특히 복소함수는 wave의 공간 변수 (공간 분포)와 시간 변수를 분리할 수 있어서 많이 사용됨. 어느 특정한 시간에서의 wave는 exp(i*k*x) 가 됨

공간주파수 k 는 3차원 공간에서의 wave propagation을 표시하기 위하여 벡터 임 [kx, ky, kz]. 각 컴포넌트로 분해될 수 있음. 만일 light wave가 z 축 방향으로 propagation 하는 경우에는 [0, 0, kz = k] 가 됨. exp(i*k*z)

파동광학으로 설명하는 현미경 해상도 및 이의 한계

이미지 형성에서도 기하광학에서는 사물의 각 포인트가 이미지 면에서 포인트로 대응된다 했는데 기하광학으로는 초점을 무한대로 작게 만들 수 있으므로 해상도의 한계를 설명할 수 없음. 이는 빛이 wave 라는 것을 무시해서 발생하는 오류임

파동광학에서는 초점은 웨이브 프론트의 각 포인트에서 출발한 웨이브 들이 서로 중첩되면서 발생한다고 설명함. 초점은 모든 웨이브들이 서로 보강간섭하면서 intensity 가 최대가 된 위치고 초점에서 벗어나면 웨이브들이 경로차이로 위상이 같지 않게 되며 이로 인해 intensity 도 감소하게 됨. 이미지 면에서 초점을 중심으로 두고 초점에서 점차 벗어나면 intensity가 감소하면서 intensity 가 0이 되는 위치가 생기는데 그 위치에서는 웨이브 페어 들이 서로 상쇄간섭을 일으키기 때문임. 초점에서의 intensity distribution을 point spread function (PSF)라고 함. 의미는 포인트가 퍼져 이미지가 된다는 것으로 우리 말로는 점 퍼짐 함수라고도 함. PSF 의 반지름이 해상도를 결정하는 인자임.

파동광학에서는 이미지 면에서는 포인트가 아니라 포인트가 퍼져 있는 point spread function 으로 대응하게 됨. 이 것이 이미지에서 해상도를 정하는 인자임

광학 현미경에서 해상도를 향상 시키려면?

사물의 각 위치에서 발산하는 빛을 대물렌즈로 더 많이 수집해야 함. 수집하는 각도가 크면 수집한 빛 웨이브 들로 초점을 만들때 좀더 작게 만들 수 있음. 수집하는 각도를 광학에서는 산술구경이라고 함 (numerical aperture, NA). 대물렌즈는 높은 배율이면서 높은 해상도 이미지 형성을 위해 매우 중요한 부품인데, 고 배율의 이미지 형성을 위해서는 초점 거리가 짧아야 하고 고 해상도 이미지 형성을 위해서는 산술구경도 커야 함

위상 현미경 (phase contrast microscopy)

세포 등 투명한 시료를 영상화 하면 영상의 대비도가 낮음. 투명 시료에서 발생하는 낮은 대비도 문제를 해결하는 기술

편광 현미경 (polarization microscopy)

크리스탈 광물 조직 등 잘 배열된 구조체들이 가지는 이방성 (birefringence) 특성을 영상화 하는 기술. 편광을 가지는 빛을 조사하고 샘플에서 투과한 빛을 교차 편광 (cross polarization) 으로 차단하면 샘플에 의해 발생한 편광 변화를 영상화 할 수 있음

형광 현미경 (fluorescence microscopy)

형광 현상을 기반으로 영상화 하는 기술로 형광 표지자로 표지한 분자체 영상화나 자가 형광을 발현하는 분자체 영상화에 적합함. 형광 표지를 통한 분자 영상이 가능하여 고 민감도 시료 분석 또는 세포 안 특정 단백질 영상화 등에 많이 활용됨

형광체는 빛을 흡수하면 획득한 에너지를 형광광 형태로 재 방출하는 물질임. 파장이 짧고 에너지가 높은 여기광을 조사하면 형광체는 여기광 빛을 흡수해서 들뜬 상태가 됨. 다시 기저 상태로 돌아올 때 형광체는 에너지를 파장이 좀 긴 형광광 형태로 방출하는데, 긴 파장의 형광광을 선택적으로 필터링 할 수 있는 광학 소자를 사용해서 형광광 만을 수집하면 형광체 위치를 영상화 할 수 있음

형광 현미경을 구성하는 요소는 높은 에너지의 여기 가능한 빛 (짧은 파장의 빛) 을 방출하는 램프, 짧은 파장의 빛은 반사하고 긴 파장의 빛은 투과시키는 이색성 거울, 그리고 긴 파장의 형광광만을 필터링 하는 필터 등이 있음.

짧은 파장의 여기광은 필터링 해 내고 긴 파장의 형광광만 수집해서 영상을 만들면 형광체가 표지된 분자 또는 물질들만 영상화할 수 있음. 분자영상에 적합하여 생물학에서 많이 사용됨

공초점 현미경 (confocal microscopy or confocal laser scanning microscopy)

3차원 해상도를 가지는 영상화 기술. 일반 현미경은 3차원 해상도가 없음. 시료가 단일세포 층이 아니라 여러층으로 겹쳐 있으면 표면의 세포층은 영상화가 가능하지만 내부층의 세포는 보이지 않음. 이는 초점이 맞지 않은 다른층의 신호가 background으로 작용하여 내부층 초점면 영상을 흐리게 하기 때문임

공초점 현미경은 초점이 맞지 않는 층에서 발생한 신호를 제거해서 초점 면 신호만으로 영상화를 가능하게 함. 이를 위해서 시료 내부에 레이저 포커스로 조명하고 반사 또는 형광으로 발생한 광을 핀홀을 통해 수집함. 초점 바깥에서 발생한 광은 핀홀을 통과하지 못하고 초점에서 발생한 광 만을 수집할 수 있게됨. 이 레이저 초점을 스캐닝하면서 신호를 획득해서 재구성하면 3차원 영상을 만들 수 있음

수퍼 해상도 현미경 (super-resolution microscopy)

광학 현미경에서는 시료의 각 포인트 들이 이미지에서는 포인트로 대응되지 못하고 point spread function (PSF)으로 대응되고 PSF 크기로 인해 해상도 제한이 발생함

수퍼 해상도 현미경은 PSF를 더 작게 만들어 해상도를 향상 시키는 기술들로 여러 방법들이 있음. STED, PALM, SIM 방법 등

STED 방법은 여기광 레이저 초점 주변에 도넛 빔을 만들어 중첩시키면 레이저 초점 (PSF 크기) 보다 더 작은 공간에서만 형광을 발생시킬 수 있음. 그래서 PSF 를 작게 만들 수 있음

PALM 방법은 형광체 활성을 조절하는 방법으로 한번에 아주 미량의 형광체만 활성화 시켜 형광이 발생하게 하면 각 활성화된 형광체가 만드는 PSF 가 중첩되지 않아 형광체의 위치를 정확히 파악할 수 있음. 이렇게 미량의 형광체 활성화, 형광광 수집, 및 위치 분석 과정을 반복하면 시료를 고해상도로 영상화 할 수 있게 됨

SIM 방법은 조명에서 아주 미세한 패턴을 조사하고 패턴 변화에 반응하는 신호를 감지해서 분석하는 방법으로, 2배의 해상도 향상을 만들 수 있음

레이저는 무엇

Stimulated emission 원리로 단일 파장의 빛을 증폭하여 발생시키는 광원으로 각 light wave 들이 in phase 로 진행함. 반면에 일반적인 광원은 파장대역도 넓고 각 light wave 사이에 위상 관계도 없어 퍼져나감

레이저는 평행광 형태로 퍼지지 않고 멀리 진행할 수 있으며 타이트한 초점도 만들 수 있음

레이저는 파워가 일정한 continuous wave 레이저와 펄스 형태의 파워를 가지는 펄스 레이저가 있음

일반적인 레이저는 CW 레이저 이며, 펄스 레이저는 평균 에너지는 낮지만 순간적 으로 에너지를 집속할 수 있어 다양한 분야에 사용할 수 있음

광센서는 어떤 것들이?

광원 뿐만 아니라 감도가 높은 광센서가 현미경에서는 필요함. 이는 시료에서의 워낙 작은 영역을 확대해서 이미징 하기 때문임. 또한 생물학에서 많이 사용하는 형광 현미경은 발현할 수 있는 형광광 세기가 제한됨.

감도 높은 광센서는 photo multiplier tube (PMT), avalanche photodiode (APD) 등이 있는데 증폭단을 가지고 있어 수집한 광자 에너지를 전자로 변환하는 과정에서 전자를 증폭하여 전기 노이즈 영향을 최소화 함

위의 광센서는 단일 픽셀 센서이고 일반적으로 사용하는 카메라는 2차원 픽셀 어레이로 구성되어 있음

카메라의 각 픽셀은 광자를 전자로 변환한뒤 전자를 well 에 축적함 (마치 버켓으로 빗물을 저장하듯이), 이후 저장된 전자 웰을 이동시키고 AD 컨버터로 디지털 신호로 변환한 뒤 영상 정보를 저장함

빛은 전자기파 (electromagnetic wave) 임 - 빛은 파동임

빛이 파동인 것은 빛의 파장으로 알고 있음. 가시광은 파장이 0.4 마이크론 - 0.7 마이크론 대역이며 무지개 빛깔 중 빨주노초파남보 중 빨간색 빛은 0.6 마이크론, 초록색은 0.5 마이크론, 그리고 보라색은 0.4 마이크론 에 해당됨

빛은 초고주파수의 전자기파 임. 빛을 포함한 전자기파의 발생(generation) 그리고 전파 (propagation)는 맥스웰 방정식으로 설명됨

맥스웰 방정식에는 총 4개의 식이 있음. 전기장, 자기장, 그리고 자기장의 시간에 따른 변화에 의한 전기장 발생, 전기장의 시간에 따른 변화에 의한 자기장 발생 등.

원래 맥스웰 방정식 중 아래 두 식들은 전기장과 자기장이 커플되어 있는데 이들을 정리해서 전기장 만 또는 자기장 만의 식으로 만들 수 있음. 이렇게 정리된 식은 이들은 전기장 (또는 자기장)의 시간의 2차미분과 공간의 2차미분 관계식 형태로 변하고 이를 웨이브 식 (wave equation)이라고 함. df2/dz2 = 1/c^2*df2/dt2

웨이브 식은 모든 웨이브 전파 현상을 설명하는 식임. 밧줄 (스트링)에서의 웨이브 전파도 설명할 수 있음. 예를 들면 스트링 줄을 따라서 공간의 2차미분 한 것은 스트링의 곡률이고 곡률이 드라이빙하는 힘으로 작용해서 가속도 (시간의 2차미분)을 만든다고 볼 수 있음 (F = ma)

웨이브 식을 만족시키는 단순한 식은 f(x-c*t) 로 표현할 수 있음. 그중 하나가 사인파 sin(x-c*t) 가 있음, 이 식은 c 의 속도로 x 축 방향으로 전파되는 사인 웨이브를 나타냄

웨이브 식에서 웨이브의 전파 속도 (c)는 웨이브 식에서의 계수로 정해짐. 전자기파의 웨이브 식에서는 계수가 전기장 유전율과 자기장 계수 값의 곱으로 나타나는데 이것이 (1/c)^2 이 됨. 진공이나 기체 형태의 공기분자로 차 있는 대기에서는 전자기파 전파속도 c 값이 3x10^8 m/s 이 되고, 유리나 물 속에서는 전기장, 자기장 계수값의 변화로 속도가 변하게 됨. 이를 다른식으로 표현한 것이 유전율 (refractive index, n)임.

이 사인 웨이브의 파장을 lamda라 하면 이 웨이브의 표현은 sin[2pi/lamda (x-c*t)] 가 되고 이를 sin(k*x - w*t)로 정리해서 표현할 수 있음. 여기서 공간에서의 계수를 웨이브 넘버 (k = 2pi/ lamda) 로 나타내었고, 시간에서의 주파수를 cyclic freq w 로 나타냄 (w = 2pi*f). 최종적인 식은 sin(k*x - w*t) 가 됨.

사인 함수 sin(k*x - w*t) 를 사인 함수를 포함하는 복소수 함수로 나타내면 exp[i*(k*x-w*t)] 가 되고 시간과 공간변수를 나눌 수 있게되어 공간에서의 웨이브의 표현은 exp(i*k*x) 가 됨

빛이 웨이브라는 것을 어떻게 관찰할 수 있나

빛은 초고주파수를 가지는 전자기파여서 웨이브를 (전기장의 진동을) 전자회로로 관찰할 수는 없음

웨이브를 관찰할 수 있는 방법은 하나의 슬릿에서 빛이 diffraction 현상으로 퍼지는 것을 관찰하거나, 두개의 빛을 만들어 이들 사이의 간섭 (interference)을 관찰하는 방법도 있음

간섭계는 두개의 슬릿을 만들고 이들을 통과한 빛들 사이의 간섭 무늬를 관찰하는 방법과 미켈슨 간섭계 등 빛을 나누고 다시 결합해서 보는 방법이 있음

두개의 슬릿을 통과한 light wave 들 사이의 간섭현상을 본 것이 Young's experiment임

미켈슨 간섭계 (Michelson interferometry)는 빛을 나누어 하나는 샘플로 나머지는 기준단으로 보낸 뒤, 이들을 다시 결합하여 간섭을 관찰하는 방법임. 샘플에 의해 발생한 변화를 민감하게 관찰할 수 있음. 파장 또는 파장 1/10 수준의 변화도 관찰할 수 있음

빛을 포함한 전자기파와 다른 파동의 공통점과 차이점

빛은 초고주파수를 가진 전자기파이므로 광학 현미경 이해에 전자기파에 대한 지식이 필요함

전자기파 특성 이해를 위해 다른 파동과의 비교가 유용함. 다른 파동으로는 소리, 물결파 등이 있음

소리는 공기 분자의 진동이 전파해 (퍼져) 나가는 것이며 스피커 등이 공기 분자를 밀어 밀도가 높은 공간이 발생하고 해소되는 과정에서 공기 분자가 앞 뒤로 진동하면서 에너지가 전파되는 것임

물결파는 돌멩이를 잔잔한 호수에 던지면 표면에서 수면의 높낮이가 생기고 물 분자가 아래 위 그리고 앞뒤로 진동하면서 진행함

전자기파의 차이점 1. 전자기파는 매질이 필요없음. 전기장과 자기장이 상호 생성하면서 전파 하므로. 반면에 음성파와 물결파는 매질 (공기, 물)이 필요함

전자기파의 차이점 2. 전자기파는 전파 방향과 전기장 및 자기장의 진동방향이 직교하는 transverse wave이고 음성파는 전파방향과 매질의 진동방향이 일치하는 longitudinal wave임. 전자기파에서는 전기장과 자기장의 진동방향도 직교하고, E x B 가 전파 방향이 됨

전자기파의 종류

전자기파는 전기장과 자기장의 상호 생성에 의해 유지되고 전파되며, 진공에서 전파 속도가 c로 일정함

하지만 전자기파의 주파수 (또는 진동수)는 엄청나게 다양함. 그러므로 파장도 달라짐 (c = lamda * freq). 전자기파는 주파수에 따라 발생과 측정 방법이 달라짐

라디오 웨이브의 주파수는 약 100 MHz 임. 이 주파수 대역의 전자기파는 안테나로 발생시킬 수 있고 수신할 수 있음. 안테나에 100 MHz AC를 걸어 전기장 (전자)을 진동시키면

가시광 빛 (visible light)은 파장이 0.4 - 0.7 마이크론 대역이고 진동수는 약 600 THz 대역임 (0.5 마이크론 파는 600 THz)

이렇게 주파수가 엄청 높은 가시광은 안테나 등 전자회로로 만들 수 없으며, 히팅을 통해 전자의 진동을 야기해서 만들 수 있음 (백열등) . 이는 흑체 복사 현상과 같음

Light wave 전파 (propagation) 표현 방법: wave front

레이 광학 (ray optics) 또는 기하 광학 ( geometrical optics) 에서는 빛의 전파를 직진하는 ray 들로 표현함. 평행광의 경우 ray 들이 서로 평행하게 진행하고, 렌즈에 의해 집속 그리고 발산하는 경우에는 ray 들이 방향이 다르게 되고 서로 교차하거나 발산함

파동 광학 (wave optics)에서는 light wave 들의 전파 및 전파 방향을 wave front 로 표현할 수 있음. wave front는 진행하는 wave 들의 peak 지점을 서로 연결한 것임. 예를 들면 연못에 돌멩이를 던저 발생시킨 물결파의 경우 wave front 가 동심원 형태로 발생함. 조그마한 안테나에서 발생해서 사방으로 발산하는 전자기파의 wave front 는 구형 (spherical shape)을 가지게 됨

ray optics 와 wave optics 의 관계에서는 각 ray 들의 수직선을 연결해서 wave front 를 그리는 것으로 설명할 수 있음

광학 영상과 관련된 wave front 들을 살펴보면, 평행광의 경우 wave 들이 위상이 같아 wave front 는 직선 형태를 이루고, 렌즈에 의해 집속 광의 경우 curved 된 wave front 를 가짐. 집속했다가 다시 발산하는 경우 wave front 의 curvature가 달라짐

Ray optics 에서 보인 렌즈에 의해 평행광이 집속광으로 변환 되는 것도, wave optics 에서는 flat 한 wave front 가 curved front 로 변환된다고 볼 수 있음. 이 경우 렌즈의 중심을 지나는 웨이브는 두꺼운 부분을 지나면서 느려져서 wave front 가 상대적으로 더 밀리고, 렌즈의 가장자리를 지나는 웨이브는 얇은 부분을 지나므로 wave front 가 덜 밀려서 curved wave front가 생성된다라고 설명할 수 있음

Flat 한 wave front 의 수직선은 웨이브 진행방향을 나타내며 wave vector (k) 라고 함. 이 것의 크기는 k = 2pi/lamda 임. 웨이브 벡터는 [kx, ky, kz] 구성 성분은 가짐. 자세한 사항은 나중에 다시 설명함

시료에 의한 wave front 변환 예

시료는 일반적으로 굴절율이 높음. 세포의 경우 단백질 핵산 등이 밀집해 있고 지질성분인 세포막으로 둘러쌓여 있어 물보다 평균 굴절율이 높음. 정확한 수치는 잘 모르며 이를 측정하는 연구가 정량 위상 현미경 (quantitative phase microscopy)으로 진행되고 있음

이러한 굴절율이 높은 시료에 flat wavefront를 가진 평행광이 입사하면 시료를 통과하면서 wave front 변화가 발생함

다른 매질에서 빛 진행속도 변화 (매질의 굴절율) 에 대한 정성적 설명

굴절율은 빛의 진행속도로 정의되며 유리나 물의 굴절율은 1.5, 1.33으로 공기 중 보다 빛이 느리게 진행함. 왜 빛의 진행이 느려질까?

이는 빛이 시료 내 원자 분자와 상호작용 하기 때문임. 예를 들면 유리에는 전기적으로 중성인 원자들이 밀집해 있는데 이 원자들이 빛의 전기장과 상호작용을 함. 전기장 내에서는 원자의 전자 전기장 힘을 받아 밀리며 원자 핵과 약간 떨어져 있는 다이폴 (dipole)을 형성함. 전자기파 진행에 따라 전기장이 진동하면 다이폴도 같은 주파수로 진동하며, 이 진동이 새로운 전자기파 (같은 주파수)를 발생시킴. 다이폴의 진동에 의해 발생하는 전자기파는 원래의 전자기파 보다 시간적으로 약간 늦어서 이들의 합도 조금 느림. 이렇게 매질 안에서는 빛이 느리게 진행하게 됨

그러므로 빛이 굴절율이 높은 시료를 통과하면 상호작용으로 주변보다 늦게 진행하므로 wave front가 변화함. 그러므로 flat 한 wave front 를 가지는 평행광이 유리와 같은 물체를 통과하면 wave front 의 변형이 발생함

매질과 빛의 상호작용은 공기 중에서 공기 분자에 의한 빛의 산란도 설명할 수 있음

빛의 전기장 내에서 공기 분자도 빛의 전기장 진동의 영향으로 진동하며 같은 주파수의 전자기파를 발생시킴. 그런데 공기 중에는 공기 분자가 서로 멀리 떨어져 있고 랜덤하게 분포하여 공기 분자에 의해 발생한 전자기파는 원래 전자기파와 같은 위상을 가지지 않음. 그래서 이 빛은 사방으로 퍼지며, 이 퍼지는 현상을 산란이라고 함

유리나 물 속에서는 원자나 분자가 밀집해 있어서 이들이 만들어낸 새로운 전자기파가 퍼지는 것 보단 wave front 의 delay 만을 일으킴. 반면에 공기 중에서는 분자들이 서로 멀리 떨어져 있고 랜덤해서 새로운 전자기파는 서로 간섭을 일으키지 않고 퍼지는 산란을 만들어 냄

다른 매질로 진행할 때 발생하는 빛의 반사와 굴절

빛이 다른 매질로 들어가는 경우 입사각을 갖고 들어가면 굴절한다는 것은 이미 위에서 설명하였음. 여기서는 이 경우 일부 빛이 반사하는 것을 이야기 하려 함. 예를 들어 유리에 비친 내 모습을 볼 수 있는데, 이는 일부 빛이 반사하기 때문임

이 반사되는 현상은 빛의 굴절과 마찬가지로 굴절율의 차이와 관계가 있음 (굴절 법칙 처럼). 예를 들면 공기에서 유리로 들어가는 빛 중 약 4%가 반사하는데 이는 굴절율이 1인 매질서 1.5인 매질로 들어가기 때문임. 그 4% 빛 때문에 유리에서 반사된 내 모습을 볼 수 있음

지금부터는 반사를 설명하려 함? 우리는 이미 어떤 파동이 다른 매질로 들어가면 일부는 반사하고 일부는 통과한다는 것을 알고 있음. 이 현상은 전자기파 뿐만 아니라 음파 등에서도 발생함

입사한 파동의 반사와 투과의 비율을 알려면 경계면을 통과할 때 변하지 않는 연속성에서 찾아낼 수 있음. 빛의 경우 경계에서 경계와 나란하게 입사한 전기장과 자기장 성분에는 연속성이 있음. 극단적인 경우 입사각이 0도 이면 전기장과 자기장 둘다의 방향은 경계와 나란함. 입사한 전기장을 E_i, 투과하고 반사하는 전기장을 E_t, E_r 이라 명명함. E_r이 E_i와 같은 방향이라 가정 한다면 입사 매질 i 에서의 전기장은 E_i + E_r 이며, 투과 매질 t 에서의 전기장은 E_t 이며 이는 경계를 통과 전후에 전기장 벡터는 변하지 않으므로 아래의 방정식이 성립함. E_i + E_r = E_t.

마찬가지로 자기장도 같은 방식으로 연속성 차원에서 분석할 수 있음. 입사 자기장 B_i 와 투과 자기장 B_t는 방향이 같고, 반사 자기장 B_r 은 입사 자기장과 방향이 달라서 (역방향 이어서) 매질 경계 통과 전의 자기장은 B_i - B_r, 통과 후 자기장은 B_t 이며, 이 자기장 성분은 통과 전후에 따라 변화가 없으므로 B_i - B_r = B_t 가 됨

B = E/v (?) 이므로 자기장 등식의 경우 E_i/v_i - E_r/v_i = E_t/v_t 가 되고 n_i*v_i = n_t*v_t = c 이므로 이 식은 n_i*E_i - n_i*E_r = n_t*E_t 가 됨

E에 관한 두개의 식이 있고 미지수가 E_r, E_t 두개 이므로, 이를 정리하면 E_r에 대한 식과 E_t에 대한 식을 얻을 수 있으며 이들은 n_i, n_t의 함수가 됨

(1) E_i + E_r = E_t

(2) n_i*E_i - n_i*E_r = n_t*E_t

여기서 n_i과 n_t가 각각 1, 1.5인 경우 E_r 이 0.2*E_i가 되고 intensity 는 (0.2)^2 이어서 0.04 즉 4%가 됨 (R = 0.04). 그러므로 투과되는 빛의 세기는 96% (=1-0.04) 가 됨

위에서는 입사각이 0도인 경우를 분석했는데 입사각이 0도가 아닌 경우에는 경계면에 수평방향인 성분과 수직방향인 성분을 분리해서 수평방향인 성분에서만 위의 논리로 분석할 수 있음

빛의 유리에서의 반사, 그리고 반사를 억제하기 위한 anti-reflection(AR) coating

빛은 다른 매질을 들어갈 때 마다 굴절할 뿐만 아니라 반사함. 위에서 보았듯이 빛의 유리에서의 반사는 공기와 유리의 굴절율 차이로 발생하며 각 면 마다 약 4%임

현미경은 여러 렌즈들로 구성되어 각 면에서의 4% 반사는 투과를 심각하게 떨어뜨림. 유리 양 면만 해도 0.96 투과가 두번 있으므로 총 0.92 (0.96*0.96)가 됨. 그러므로 반사를 억제해야 시료에서 발생한 빛을 카메라로 효율적으로 전달할 수 있음

또한 안경의 경우도 반사로 인해 안경을 착용한 사람의 눈을 잘 보기 힘들어 반사 억제가 필요함. 반사를 억제하는 방법은 유리막에 anti-reflection (AR) coating을 함

AR 코팅은 빛의 파장의 절반 또는 1/4인 두께의 얇고 투명한 막을 쌓아 올림. 이 막들에서도빛 웨이브 들이 반사할 텐데, 이들 반사하는 웨이브들이 상쇄간섭이 일어나도록 막들을 쌓아 올림

빛의 회절 (light wave diffraction)

빛은 웨이브 이므로 diffraction 함. 다르게 말하면 빛이 장애물을 만나 차단되면 빛은 웨이브 이므로 장애물을 통과한 빛의 wave front는 점점 퍼져 나감. 이를 diffraction 이라 함

Diffraction 현상은 어느 웨이브에서나 발생함. 음파의 경우 차단 장애물 뒤에서도 들리는데 그게 장애물을 피해 통과한 음파가 다른 벽에서 반사되어 들릴수도 있지만 반사벽이 없더라도 장애물을 통과한 웨이브들이 점점 더 퍼져서 들리는 것도 있음. diffraction 현상은 물결파에서 쉽게 관찰할 수 있어서 이를 가시화 한 이미지들이 있음

Diffraction 현상은 슬릿을 활용하여 막고 일부만 통과 시키면 관찰할 수 있음. 슬릿을 통과한 웨이브들은 점차 퍼져나가는데, 퍼져나가는 정도는 슬릿의 크기에 따라 달라짐. 슬릿이 크면 덜 퍼져 나가고, 슬릿이 작으면 통과한 웨이브가 더 큰 각도로 퍼져 나감. 그러므로 슬릿의 크기에 따라 diffraction 으로 퍼지는 각도가 달라짐

여기서 슬릿의 크기는 웨이브의 파장 기준으로 이야기 함. 파장에 비해 훨씬 크면 퍼지는 각도가 작고, 파장에 근접할 정도로 작으면 크게 퍼져나감. 물결파의 경우 파장이 상대적으로 길기 때문에 슬릿으로 막았을 때 발생하는 diffraction을 잘 관찰할 수 있음

웨이브의 diffraction 현상은 Huygens' principle 로 설명함. 슬릿을 통과한 웨이브 들의 wave front 에 있는 모든 점들이 광원이며 각각이 wavelet 을 발생시킴 (같은 파장의). 이 wavelet 의 front를 다시 연결한 wave front 가 그 다음 wave front 가 됨

만일 슬릿 오프닝이 크면 슬릿을 통과한 웨이브 들은 긴 직선의 wave front로 시작하는데, 각 점에서 발생한 wavelet 들을 이어서 얻은 wave front는 거의 직선이고 끝 점에서만 코너에서만 휘게 됨. 반면에 슬릿 오프닝이 작으면 통과한 웨이브들의 wave front 는 짧은 선이 되고 wave front의 모든 점에서 발생한 wavelet 들로 형성되는 다음 wave front는 직선 구간보다 곡선 구간이 더 많아 휘게 되는 것임

슬릿 뒤의 어느 지점 에서도 웨이브가 도달하는 것으로 해석 가능함. 그 지점에서 웨이브 상태는 wave front 의 각 지점이 발생시킨 wavelet 이 서로 중첩하는 결과로 볼 수 있음. 위에서 말한 퍼지는 각도도 diffraction pattern 의 첫번째 최소점의 각도로 해석 가능함

빛은 파장이 매우 짧으므로 (0.5 마이크론) diffraction 으로 퍼져나가는 것을 쉽게 보기 어려움. 우리가 일상적으로 접하는 물체는 빛의 파장에 비해 훨씬 크기 때문에 빛 웨이브는 가려져서 그림자가 생기는 것으로만 보이며, 퍼지는 것은 잘 보이지 않음. 하지만 아주 조그마한 구멍을 통해 빛을 통과시켜서 좀 멀리 떨어진 스크린에서 보면 빛이 퍼지는 것을 볼 수가 있음. 스크린에 나타나는 패턴은 가운데 밝은 영역이 있고 그 주변에 동심원 패턴이 나타남. 가운데의 밝은 영역도 구멍보다는 크게 분포함

빛이 퍼지는 현상은 현미경 영상화에서 중요함. 보고자 하는 시료가 마이크로 크기의 구조를 가지면 이를 지나는 빛들은 diffraction 현상으로 퍼져 나감. 시료의 구조가 작으면 작을 수록 퍼지는 각도가 더 커지므로 이를 잘 수집하려면 산술구경이 큰 대물렌즈가 필요함

슬릿을 통과한 빛의 회절 패턴 (diffraction pattern)의 디테일

슬릿을 통과한 빛은 처음에는 슬릿의 모양을 따르다가 점차 퍼져나감. Huygens' theory 를 활용해서 wave front 가 점점 바뀌면서 슬릿보다 더 큰 모양을 가지며 일정 거리 이후에는 그 모양이 변하지 않고 점점 커져 가기만 함. 이 모양을 Fraunhofer diffraction 이라고 함

프라운호퍼 회절 패턴은 충분히 거리가 떨어진 곳에서 발생하는데 이 것은 슬릿 오프닝을 통과한 웨이브들의 wave front 각 포인트에서 출발하는 웨이브가 flat 한 wave front 를 가진 상태에서 스크린에 도달했으며 그 웨이브들의 중첩되면서 패턴이 만들어 지는 것임. wave front 각 포인트에서 출발한 웨이브는 스크린 센터 지점 근처에서는 일정 각도를 갖고 통과하며 (wave vector 가 다름) 이들을 합치는 것은 푸리어 변환으로 설명할 수 있음. 즉 푸리어 변환은 먼저 소스 필드 wave front 의 각 지점과 스크린 센터 지점을 연결하는 방향으로 지향하는 평면 웨이브가 서로 중첩하는 것으로 해석하고 이를 제곱하면 이미지가 나타남

더블 슬릿을 통한 빛 간섭 패턴

두개의 위상 일치 광원에서 출발한 빛이 상호 간섭하여 만드는 패턴임. 두개의 빛 웨이브가 결합할 때, 이들의 위상차에 따라 스크린에서는 보강간섭과 상쇄간섭이 발생함. 예를 들면 점광원 사이 가운데 지점에서는 위상차이가 0 이므로 보강간섭이 일어나고 센터에서 벗어나면서 두 빛 웨이브 사이에 위상차가 발생하며, 이들의 위상차가 파장의 절반이 되는 지점에서는 상쇄 간섭 그리고 위상차가 파장의 1배가 되는 지점에서는 보강 간섭이 일어남. 그러므로 이러한 상쇄 및 보강 간섭이 반복함

대물렌즈의 NA에 따른 (포인트 광원의 이미지인) 점 퍼짐 함수의 크기 변화

포인트 광원에서 출발한 빛 웨이브들을 대물렌즈로 수집하여 이미지를 만들면 포인트가 아니라 포인트가 퍼져있는 점 퍼짐 함수 (point spread function, PSF)가 됨

포인트 광원에서 출발한 빛은 사방으로 퍼지는데, 그중 대물렌즈의 NA 만큼만 수집할 수 있음. 여기서는 대물렌즈의 NA가 슬릿의 오프닝 크기 역할을 한다고 볼 수 있음

대물렌즈를 통과한 빛의 wave front 는 플랫 하고 튜브렌즈를 통해 커브지면서 초점거리 위치에서 이미지를 형성함. 여기서 커브 진 wave front 의 각 포인트에서 출발하는 웨이브들은 센터 지점에서 위상이 일치하게 도달하고 밝은 포인트를 만듦. 그러면 센터 지점에서 벗어난 곳에서는? offset 위치에서는 상쇄간섭이 일어나는 포인트가 있음. 마치 싱글 슬릿을 통과한 빛의 회절 패턴과 같이. 이는 wave front 의 길이에 따라 PSF 크기가 달라짐

그러므로 NA 에 따라서 PSF 크기가 반비례 하며 즉 해상도도 NA에 의해 결정되는 것임

빛은 광자 (photons) 임 - 입자성

빛이 광학 영상을 통해 시료의 정보를 전송하는 경우에는 light wave 로 진행하지만, 시료와의 상호작용을 할 때는 광자 (photon) 로 동작함. 광자는 빛이 물질의 분자 및 원자 내 전자와와 상호작용 (즉 흡수, 형광 등)을 할 때 나타나는 빛의 성질로, 빛의 에너지 패킷 단위임

분자와 원자 내 전자의 분포는, 양자역학을 따르며, 특정 에너지 준위에만 위치함. 기저 에너지 준위 (ground state), 들뜬 (여기) 에너지 준위 들 (excited states) 등이 있으며 전자는 그 에너지 준위들에서만 존재하고 아무 에너지나 가질 수는 없음

빛과 물질의 상호작용의 예로 흡수 (absorption)가 있는데, 흡수가 되려면 물질의 기저 준위에 있는 전자가 충분한 에너지를 획득해서 여기 에너지 준위로 가야함. 이를 위한 충분한 에너지를 받아야 하는데 이는 광자 형태로 에너지를 받음. 또한 여기 에너지 준위에 있는 전자가 기저 준위로 갈 때는 차이 에너지를 방출해야 하는데 광자 형태로 방출할 수도 있음

그러므로 빛이 원자 분자 내 전자와 상호작용을 할 때에 빛은 광자 형태로 에너지를 공급하며, 에너지 방출 시에도 광자 형태의 방출도 가능함. 광자의 에너지 E = h*f 이며, 광자가 갖고 있는 에너지는 빛의 주파수에 비례해서 커짐. 즉 주파수가 높아질 수록 광자의 에너지가 높음

광자의 존재와 특성은 광전효과 (photoelectric effect)로 발견하였음. 빛을 진공 속 금속에 비추면 에너지를 받아 이온화 되어 최외곽 전자가 튀어 나오는데, 이온화를 만들기 위해 충분한 에너지를 공급하는 방법은 빛의 세기를 올리는 게 아니라 빛의 주파수를 높여야 했음. 그리고 이온화 된 전자가 갖고 있는 운동 에너지는 광자 주파수에 비례하였음

물질에서 빛의 흡수가 발생하려면 기저 에너지 준위에 있는 전자가 들뜬 에너지 준위로 가기위한 에너지가 필요하며, 일정 주파수 이상의 광자가 필요함. 빛의 흡수를 여기 (excitation)이라고도 함. 그러므로 여기를 위해서는 특정 주파수 이상 또는 특정 파장 이하의 빛이 필요함. 예를 들면 물과 유리는 가시광은 통과시키지만 이보다 주파수가 높은 자외선은 흡수함. 물 분자는 자외선 주파수 대역에 여기 에너지 준위가 있기 때문임. 가시광을 흡수 없이 통과시키는 이유도 가시광 주파수 대역에는 에너지 준위를 갖고 있지 않기 때문임

들뜬 에너지 준위의 전자는 높은 에너지를 갖고 있어 화학 반응을 일으킬 수 있으며 이를 통해 에너지를 방출하기도 함. 화학 반응 없이 기저 상태로 돌아갈 때는 열에너지 등으로 방출함. 또한 특정 구조를 가지는 분자체는 에너지를 광자 형태로 방출함. 예를 들면 물에 흡수된 자외선 광자의 에너지는 물 분자의 이온화를 일으키고 화학반응성을 높임. 유리의 경우 흡수된 광자 에너지는 열에너지로 방출하면서 조금 따뜻해 짐

여기된 전자가 에너지를 광자로 방출하는 현상을 형광 (fluorescence)이라 하며 이러한 분자체를 형광체 (fluorophore)라 함. 즉 형광은 고에너지 광자를 흡수하여 여기된 분자가 기저 준위로 돌아갈 때 에너지를 광자로 방출하는 현상을 의미함. 형광으로 방출되는 광자는 여기 준위와 기저 준위 사이의 에너지 차이에 해당되는 주파수를 가짐 (E_ex - E_gr = h*f). 형광으로 방출되는 광자의 주파수는 흡수에 필요한 광자의 주파수 보다 낮은데, 이는 여기 에너지 준위에 있는 전자가 광자로 에너지를 방출하기 전에 약간의 손실이 있기 때문임 (vibrational relaxation). 들뜬 상태의 전자는 vibrational relaxation (에너지 dissipation)을 통해 들뜬 상태 에너지 준위 중 가장 낮은 에너지 준위로 신속히 이동하고 거기서는 상대적으로 안정적이어서 일정 시간 머물음 (lifetime, ns 단위). 하지만 거기 역시 높은 에너지 준위이므로 불안정 하며 결국 기저 준위로 내려오면서 광자로서 에너지를 방출함. 그래서 형광으로 방출된 광자는 여기에 필요한 광자보다 에너지가 낮으며 주파수도 낮음

형광 현상을 일으키기 위해서는 여기광이 특정 주파수 이상 (특정 파장 이하)이 되어야 하고 분자의 전자는 이 에너지를 흡수해서 여기 준위로 옮겨감. 형광물질이 에너지를 방출하면서 만드는 형광광은 여기광 보다 주파수가 더 낮으며, 파장은 더 길어짐. 그러므로 형광광을 여기광과 쉽게 분리할 수 있으며 형광광 만을 수집하여 형광광을 방출하는 형광체의 위치를 영상화 할 수 있음. 이것이 형광 현미경의 원리 임

정리하면 빛의 흡수와 형광 등 시료의 분자와의 상호작용에서는 시료는 광자로 빛 에너지를 받고 광자로 빛 에너지를 방출함

빛의 파동성과 입자성 즉 이중성

빛은 초고주파수 전자기파 형태로 정보를 전달하고 분자와 상호작용을 하는 경우 빛의 에너지는 광자로 quantized 되어 있음. 그러므로 파동성과 입자성을 동시에 가지고 있음. 그래서 광자가 웨이브 형태로 진행한다고 볼 수 있음. 이를 빛의 이중성 (duality)라고 설명함

빛의 이중성은 더블 슬릿 실험에서 확인할 수 있음. 기존의 더블 슬릿 실험과 달리 여기서는 빛의 세기를 극단적으로 낮춰 광자 하나씩 더블 슬릿을 통과하게 함. 더블 슬릿을 통과한 광자는 광센서로 감지할 수 있고 광자가 도달한 위치를 표시할 수 있음. 한번에 하나의 광자만 광센서에 도달한다면 더블 슬릿의 한쪽만 통과해서 감지될 것임. 하지만 이 실험을 반복하면 더블 슬릿의 간섭 패턴이 나타남. 그래서 광자 단위로 센싱 하더라도 광자의 파동성은 그대로 유지됨

빛이 파동성과 입자성을 동시에 갖고 있듯이 모든 물질은 이중성을 갖고 있음. 예를 들면 전자는 질량과 모멘텀을 갖고 있는 입자인데 전자의 전파 (propagation)와 전자 현미경 이미징에서는 회절 간섭 등 파동성이 나타남. 그러므로 전자도 이중성을 갖고 있음. 물질이 파동 성질을 갖고 있다는 점에서 이를 물질파라 하며, 전자의 파장은 lamda = h/p 로 계산할 수 있음. 여기서 h는 플랑크 상수임. 전자현미경에서의 해상도는 수 나노미터 단위로 전자의 모멘텀과 관계하고 파장에 의해 결정됨. 모든 물질은 파동성을 갖고 있지만 모멘텀이 커서 파장이 짧고 그래서 탐지가 잘 되지 않는 것임. 하지만 모든 물질은 파동성을 갖고 있는 것은 사실임

눈의 망막

눈은 렌즈와 카메라 구조를 갖고 있음. 눈의 전안부에는 굴절율 조절 가능 렌즈 역할을 하는 각막과 수정체 조합이, 후안부에는 카메라 역할을 하는 망막이 위치하고 있으며 사물에서출발한 빛들을 수집하고 굴절하여 망막에 이미지를 형성함. 이들 사이의 거리는 약 25밀리미터 이며 각막의 고정된 굴절파워가 약 25 디옵터 정도 됨. 망막에는 두 종류의 시세포가 있는데 콘 (모양) 셀, 로드 (모양) 셀 들이며 각각 빛을 감지해서 액션 포텐셜 전기 신호를 발생해서 이미징함. 이 시신경 세포들은 황반 (fovea)이라는 영역에 빽빽히 있으며 카메라 픽셀 역할을 함. 황반에는영상촬영에 방해가 되는 혈관도 없음

콘 (모양) 셀은 컬러를 감지하는 세포로 세가지 다른 주파수의 가시광을 감지하는 세가지 세포들이 있음. 로드 (모양) 셀은 컬러 가 없는 이미지 형성에 기여하며 콘 모양 세포 보다 민감도가 높음. 이들 시신경 세포는 빛 환경에 따라 민감도를 조절할 수 있음. 햇빛이 많은 낮에는 홍채는 작아지고, 시세포는 threshold 를 올려서 saturation 없이 볼 수 있게 적응하고 깜깜한 밤에는 홍채가 열리고 시세포는 threshold 를 낮춰 빛을 최대한 감지해서 사물을 볼 수 있게 됨. 그러므로 낮에도 밤에도 눈의 영상기능은 잘 동작함. 물론 어두울 때는 로드 (모양) 셀만이 동작하여 컬러 없이 사물을 인식하는 정도가 됨

눈 망막의 시세포들도 빛을 광자로 인식함. 에너지가 낮은 근적외선은 감지하지 못하고 가시광선 대역 만을 감지함. 그 보다 에너지가 높은 자외선은 물 흡수로 시세포에 도달하지 못못함

빛의 다양한 표현법

빛을 표현하는 방법은 다양함. 단순한 레이에서 부터 웨이브, 편광을 포함한 웨이브 등

가장 간단한 것은 직진하는 레이 (ray)로 표현하는 것이며 (다른 말로는 기하광학, geometrical optics 라 함) 이는 이미지 면, 초점 위치, 배율 등을 파악하는데 효과적임. 빛이 wave 라는 것을 무시하고. 레이는 y 위치와 theta 방향으로 표현할 수 있음. 빛이 wave 라는 것을 무시할 수 있는 이유는 파장이 어차피 매우 짧기 때문임

그 다음은 빛을 wave 로 표시하는 것임. 이를 통해 회절, 간섭 등을 표현할 수 있으며 이미징 시스템의 모델을 만들 때도 도움이 됨. Wave 를 사인 함수 sin (k*x-w*t) 형태로 나타내거나. exp[j*(k*x-w*t)] 복소수 형태로 나타낼 수도 있고 시간을 고정하고 공간 상에서 표현할 때는 exp(j*k*x) 또는 k vector와 r 벡터의 내적. exp[j*(kx*x + ky*y + kz*z)] 로도 나타냄. 이를 스칼라 웨이브 라고도 하는데 편광을 고려하지 않아서 하나의 웨이브로 표현될 수 있기 때문임

예를 들면, z 축 방향으로 진행하는 평면파는 exp(j*k*z) 로 표현할 수 있음. 이 것은 z 만의 함수 인데, z 위치가 정해지면 x 나 y 위치는 상관이 없기 때문임. k 는 웨이브 넘버라 하며 공간 주파수 개념임

그 다음은 빛 웨이브를 편광을 포함해서 표현하는 방법임. 가장 구체적인 방법임. 빛은 그냥 웨이브가 아니라 전자기파 임. 그러므로 편광이 있음. 어느 한 방향을 진행하는 전자기파에도 다양한 편광 상황이 존재함. z 방향으로 진행하는 전자기파를 나타내기 위해서는 전기장의 x 와 y 축 컴포넌트 (Ex, Ey)가 필요하며 두 컴포넌트 사이의 위상 정보 (relative phase)가 필요함. 이를 벡터 웨이브라 함

현미경의 광원

현미경에는 다양한 광원이 사용됨. 할로겐 램프, 수은 램프, LED, 그리고 레이저

일반 투과형 현미경에는 할로겐 램프 백색광이, 형광 현미경에는 주파수가 높은 자외선을 방출하는 수은 램프가 사용됨. 일반 투과 현미경은 시료에 의한 빛의 흡수로 나타나는 대비도로 영상화 하므로 다양한 파장을 포함하는 백색광이 적합함. 이들은 시료의 field of view (FOV) 전체를 한번에 조명하는 wide field 영상화에 적절함

현미경의 영상화 영역은 (FOV) 대체로 밀리미터 스케일로 작아서 이 영역에 조명광을 집중해야 하며 빛의 세기가 높아야 함

할로겐 램프는 예젠에 실내 조명에 사용했던 백열등과 마찬가지로 필라멘트에 많은 전류를 흘리고 저항 열로 온도를 상승시켜 전하를 띈 입자들이 진동해서 빛을 내는 방법임. 이 방법은 black body radiation 을 따르며, 온도에 따라 빛의 스펙트럼이 달라짐. 고온이 될 수록 더 높은 주파수의 광자를 방출함. 태양은 온도가 6000 도 여서 가시광 주파수에 피크가 있으며, 백열등과 할로겐 램프는 온도가 더 낮아 적외선에 피크가 있음. 할로겐 램프는 할로겐 개스가 들어 있어 일반 백열등 보다 더 고온으로 가열할 수 있고 밝기도 높음. 산화 문제 없이.

수은 램프는 아크 램프의 일종인데, 아크 램프는 arc discharge lamp 라고 하고 번개에 의해 통전 하는 것과 같음. 아크 램프는 낮은 압력의 기체 분자로 채워진 진공관의 전자총에서 나온 고속 전자가 기체 분자와 부딪혀서 기체를 이온화 시키고 플라즈마 (이온화된 전자와 원자)를 발생시킴. 플라즈마 상태의 이온화된 전자가 소량으로 포함된 특정 기체를 여기 시키고, 여기된 기체의 전자가 기저 레벨로 다시 진입할 때 에너지 차이에 해당되는 광자를 방출하여 빛을 발생시킴. 아크 램프에서 방출된 빛의 스펙트럼을 보면 그 기체 물질의 에너지 준위를 알 수 있음. 진공관에 포함되는 기체로는 수은 기체 (수은 램프), 제논 기체 (제논 램프), 소디움 메탈 기체 (소디움 램프), 메탈 할라이드 (metal hallide salt) 기체 (자연광을 발생 시키는 램프), 네온 개스 (네온 램프), 아르곤 개스 (아르곤 램프)등이 있음. 그러므로 이들 아크 램프는 특정 파장 대의 빛을 방출함. 진공관에 들어있는 기체에 따라서 빛이 달라짐. 수은 램프의 경우 자외선 (ultraviolet, UV) 대역에서. 소디움 등의 경우는 589 nm 의 노란색 빛을 방출. 네온 램프는 빨간색 오렌지색, 아르곤은 파란색 빛을 방출함

아크 램프는 강한 빛을 방출해서 야외 필드의 조명에 요즘도 사용되며, 현미경 광원으로 사용됨. 그 중 제논 램프, 머큐리 (수은) 램프 등이 현미경에 사용됨. 자외선 등 특정 대역을 커버 (수은 램프) 하거나 넓은 대역 (제논 램프)을 커버하면서 빛을 방출하는데, 빛이 강하며 안정적임

LED 는 light emitting diode 의 약자로 전기를 통하면 특정 파장대의 빛을 방출하는 전자소자 임. 특수 물질로 만든 PN junction 다이오드 반도체로 이 정션에 전기가 흐르면 (통전되면) conduction band 에 있는 자유전자가 valence band 에 있는 홀과 만나게 되며 이들의 에너지 차이가 광자로 방출됨. Energy band gap 의 크기에 따라 광자의 주파수가 결정됨. 빨간색과 초록색 빛을 방출하는 LED는 상대적으로 쉽게 개발되었으나 파란색 광자를 방출하는 것은 최근에 개발되었음. 이들의 조합을 활용하여 백색광 조명에도 쓸수 있게 되었으며 현미경에서도 사용됨

LED는 특정 파장대 빛을 방출하나, 뒤에 나오는 레이저 처럼 단일 파장은 아니지만 특정 파장 대역에 국한되어 방출함 (빨간색, 초록색, 파란색 등). 다른 파장을 내는 LED를 조합하면 백색광을 만들수 있으며, 단일 특정 파장대역 LED 로 wide field imaging, fluorescence imaging 등의 광원으로 사용됨

마지막 광원으로 레이저가 있음. 레이저는 위의 광원과 많이 다른 특성을 갖고 있는데 이는 만드는 방법이 다르기 때문임. 레이저는 단일파장 (single wavelength)이면서 결맞음 특성 (coherence)을 가지는 광원임. 단일 파장의 웨이브 들이 같은 위상으로 전파 하므로 flat 한 wave front을 가지며 발산하지 않고 평행광으로 멀리 보낼 수 있음. 레이저 포인트로 사용되거나 군사적으로 레이저 빔으로 사용될 수 있음. 이는 여러 파장이며 사방으로 퍼지는 다른 빛과는 차이가 남. 현미경에서는 평행광 레이저 빔을 렌즈로 굴절시켜 타이트한 초점을 만들 수 있고 초점을 스캔하고 초점에서 나오는 빛을 핀홀로 필터링 해서 3차원 영상화도 가능함. 공초점 현미경이 대표적인 레이저 스캐닝 기술임

레이저는 stimulated emission 을 통해 빛을 방출함. 일반적인 emission 은 spontaneous emission 이며, stimulated emission은 여기준위에 있는 전자가 어떤 자극에 의해 기저 준위로 내려오면서 광자를 방출하는 것임. 여기서 자극은 이전에 spontaneous emission 으로 방출된 광자인데 광자가 갖고 있는 에너지가 전자가 갖고 있는 에너지와 같아서, 전자는 자극하는 광자와 같은 에너지를 가지는 또다른 광자를 방출함. Stimulated emission은 즉각적 이어서 방출된 광자는 자극한 광자와 같은 위상을 가짐. 이를 통해 광자의 갯수가 증가하면서 증폭됨

이러한 stimulated emission 이 발생하려면 먼저 기저 에너지 준위보다 여기 에너지 준위에 전자를 갖고 있는 (여기된) 원자들이 많아야 하며 (population inversion 이라 함), stimulated emission으로 발생한 광자를 cavity 안에 가두어 광자가 여기된 원자와 자주 접촉하게 해야 함. 이러면 stimulated emission 에 의한 광자 증폭이 발생하는데, cavity 안에서 스탠딩 웨이브를 만들 수 있는 주파수 또는 파장의 광자 만이 유지 증폭되며 이 빛의 일부를 꺼내어 사용하는 것이 레이저 임. 방출된 빛만큼 발생한 손실은 cavity 안에서 증폭으로 만들어지고, 손실과 게인이 같아지는 상태에서 레이저가 안정적으로 유지됨

레이저 빛은 지속적으로 유지되는 스탠딩 웨이브에서 출발한 것이어서 wave front 가 일정하고 평면파 등이 가능함. 그러므로 레이저는 발산없이 진행할 수 있음. 지난 웨이브 옵틱스 강의에서 보여줬던 wave front 가 일정한 빛은 모두 레이저에서 나온 것이라 보면 됨. 반면에 LED의 경우 광자가 만드는 wave 들 사이 위상이 일정치 않음. 레이저를 제외한 모든 광원은 위상 관계가 유지되지 않고 레이저 만 특별한 경우임

레이저는 광학 측정, 광학 영상, 그리고 현미경 영상에 사용됨. 광학 측정은 간섭계를 활용하여 미세 거리변화를 측정하는 것이고, 광학 영상 또는 현미경 영상에서는 홀로그램 등 위상 영상에 활용됨. 위의 레이저 스캐닝 현미경도 물론 레이저가 활용됨

간섭계는 빛을 나누고 경로차이를 두고 다시 결합했을 때 발생하는 간섭을 측정하는 장치로, 샘플에 의한 (빛 파장 단위의 서브 마이크론 아니 나노 단위의) 미세한 경로차이 변화를 감지할 수 있음. 광학 현미경 영상에서는 간섭계를 활용해서 시료에 의한 위상 변화를 측정해 영상화 할 수 있음. 이 경우 기준단의 경로를 스텝으로 변화시킬 수도 있고 기준단 광을 사선으로 조명해서 간섭패턴을 만들어 분석할 수도 있음

간섭계를 만들기 어려운 경우에는 레이저 등으로 평면파를 조명하고 샘플에서 발생하는 회절 모양을 분석할 수도 있음. 여기서 회절모양 분석은 간섭계 없이 하는 것임

다른 광학 현미경 영상으로는 간섭계를 활용해서 빛의 반사 깊이를 측정해 조직을 영상화 하는 기술도 개발되었음. 이는 레이저를 사용하지 않아 다음번에 설명하겠음

레이저 활용 범위 (일상 생활)

레이저는 반도체 레이저 소자가 개발되면서 저가로 대량생산 그리고 소형화 할 수 있어서 다양하게 활용되고 있음. 레이저 포인터, 컴팩트 레이저 디스크, 레이저 바 코드 스캐너, 레이저 프린터, 광섬유를 통한 광 통신 등이 있음. 이들은 레이저 포커스를 쉽게 할 수 있고 포커스에 빛의 세기가 강하다는 것을 활용하는 것 들임

레이저의 활용: 의료

레이저는 의료에도 많이 사용되는데 이는 특정 파장의 강한 빛을 광 섬유 등으로 전달할 수 있기 때문임. UV에서 IR 까지의 대역을 커버하는 다양한 파장의 고출력 레이저가 개발되어 피나지 않는 수술 (레이저로 혈관을 태워서) , 피그먼트 제거 (주변 조직은 보호하면서) 등에 사용되고 있음. 레이저의 의료활용을 이해하려면 빛과 조직의 상호작용 즉 흡수 스펙트럼에 대해 이해할 필요가 있음

레이저 치료는 주로 조직 내 흡수체의 열적 파괴를 활용함. 산업에서 사용하는 레이저 가공과 유사한 특징이 있음. 조직은 주로 세포와 물로 이루어져 물, 단백질 등의 흡수 스펙트럼을 먼저 알아야 하고 (가시광 대역에서는 투명하지만 자외선 적외선 파장에서는 흡수도가 있음), 조직 구성 성분 중에는 멜라닌과 피 등 빛의 흡수를 잘하는 특정 흡수체 들이 있음. 헤모글로빈은 혈관을 태우는데 중요한 흡광체 이고, 멜라닌은 얼굴에 색소침착의 원인이어서 선택적 치료가 필요함

물과 단백질은 가시광에서 투명함. 그래서 가시광 근적외선 대역에서는 흡수가 없는데. 하지만 자외선 대역과 중 적외선 대역에서는 흡수가 있음. 이를 활용하여 표면 조직 제거 등을 시행함. 이들 레이저는 중 적외선 대역의 CO2 레이저, 자외선 대역의 엑시머 레이저가 있음

헤모글로빈의 경우 빨간색을 띔. 이는 빨간색 파장 빛은 통과 시키고, 파란색 초록색 파장 대역의 빛은 흡수한다는 의미임. 헤모글로빈은 혈액 적혈구에서 산소를 전달하는 전달체 이며 산소 결합 유무에 따라 색이 좀 달라짐. 산소가 있을 때는 빨간색 흡수가 최소화 되어 선홍색을 띄고, 산소가 없을 때는 빨간색 빛 흡수를 상대적으로 더 해서 색깔이 좀 더 칙칙해 짐. 산소 결합 유무에 따른 흡수도의 차이로 산소 포화도 측정이 가능하며 이를 활용하는 기기가 손가락 끝에집게 형태로 착용하는 산소 포화도 측정 기기임

멜라닌은 태양광으로 부터 세포를 보호하기 위해 멜라노사이트라는 피부 상피 세포가 분비하는 흡광물질임. 멜라닌은 대체적으로 상피 기저에 있는 줄기세포의 핵 부위를 감싸고 있으며, 빛에 의한 핵의 손상을 막는 역할을 함. 그런데 과도한 세포 반응으로 멜라닌이 집중적으로 침착되하게 되면 피부 기미 주근깨 등이 발생함. 이들은 레이저로 선택적으로 태워서 제거할 수 있음. 멜라닌은 검은색인데 대체적으로 모든 가시광 파장에서 흡수가 일어난다는 의미임. 그래도 파장이 길어지면 흡수도가 떨어지기는 함. 멜라닌 제거는 어느 가시광 파장에서도 가능하지만 가시광 파장은 혈관 내 헤모글로빈 흡수에 의한 손상도 있을 수 있어 이를 피하기 위해 헤모글로빈 흡수가 낮아지는 근적외선이 더 나음.

치료에 사용되는 레이저는 다음과 같음. 10 마이크론 대 파장의 CO2 레이저는 물 흡수가 높아 물로 구성된 모든 생체조직을 태울 수 있어서, 조직 표면에 있는 주름 제거에 활용됨, 488 nm 파장 (푸른색)의 아르곤 레이저는 혈관에서의 선택적 흡수를 통한 태우기, 1064 nm 파장의 야그레이저는 주변조직 손상을 최소화 하면서 피그먼트 제거에 활용됨. 200nm 대 엑시머 레이저는 물 단백질 등의 화학적 분해로 조직을 제거함. 야그레이저의 파장은 다른 것들에서는 흡수가 최소화 되고 피그먼트는 흡수가 상대적으로 높아 이를 제거할 수 있으며 파장이 길어 조직 침투 깊이도 증가함

열적 파괴 시 주변 조직의 손상을 최소화 할 필요가 있으며 이를 위해 펄스 레이저를 사용함. 펄스 레이저는 레이저 출력이 펄스 형태로 나옴. 펄스 레이저는 펄스가 on 상태 동안 열적 파괴를 시행하고 off 상태 동안 열이 주변 조직에 분산되어 주변 조직을 식히는 효과가 있음 (일정 온도 이상 상승하는 것을 피할 수 있음). 열이 분산되는 시간은 약 나노초 정도 되어 나노초 펄스 레이저를 사용하면 주변조직 열적 손상 없이 피그먼트만 제거할 수 있음

펄스 레이저 중에 펄스 폭이 피코초, 펨토초로 매우 짧은 레이저가 있음. 이들 레이저는 짧은 펄스 시간 동안 모든 광자가 집중되므로 비선형 흡수 현상을 일으킬 수 있음. 비선형 흡수라 함은 흡수에 필요한 에너지를 조명광의 광자는 갖고 있지 않은데 (주파수가 낮고 파장이 길어서), 이 레이저로 초점을 만들면 초점 영역에서는 광자의 밀도가 너무 높아서 한 분자체가 두개의 광자를 동시에 받아들여 흡수에 필요한 에너지를 획득할 수 있게 됨. 분자체가 광자를 받아들이는 확률을 p 라고 하면, 비선형 흡수에서는 p^2 이 되어 비선형 상태가 됨. 비선형 흡수에서는 빛이 초점에서만 흡수되어 이온화 되고 3차원 초점 부위만 화학적으로 분해 할 수 있어 조직에 미세한 구멍을 낼 수 있으며, 스캐닝하면서 구멍을 연결하면 절개가 가능하짐. 실제 펨토초 레이저는 각막 굴절율 교정 수술에서 각막의 3차원 미세절개에 사용됨. 투명한 각막 조직의 500 마이크론 깊이에 초점을 맞추면 초점에서만 조직 파괴가 발생하고 이를 스캐닝해서 500 마이크론 두께의 얇은 절편을 만들 수 있음. 절편으로 만들어진 각막 조직을 젖히고 아래 부분을 엑시머 레이저로 화학 결합을 끊어 표면 조직을 제거하고 표면 굴곡을 변화시킬 수 있음

펨토초 레이저를 활용한 3차원 가공 등은 정밀한 유리기판 자르기에 활용됨. 휴대전화 유리 기판. 펨토초 레이저 초점에서 발생하는 다광자 이온화는 생체 조직 뿐만 아니라 유리 등 투명한 어느 물질에서도 가능함. 다광자 이온화를 통해 충분한 에너지를 3차원 적으로 제공할 수 있음

광학 필터

광학 필터는 빛의 세기와 파장을 조절하는 광학 소자 임. 주로 유리 판에 얇은 막을 적층해서 만듦

광학필터는 빛의 세기를 파장에 관계없이 낮추는 neutral density (ND) 필터와 특정 파장만 투과시키는 컬러 필터가 있음. ND 필터는 아크램프 같이 광원 자체에서 빛의 세기를 조절하지 못할 때 사용하며 1/10, 1/50, 1/100 비율로 감소시키거나 그보다 훨씬 감소 시킬 수 있음

컬러 필터도 아크 램프와 같이 여러 파장 대역의 빛을 방출하는 광원에서 특정 파장 대역을 잘라서 사용할 때 사용함. 선택적 흡수 또는 간섭을 활용한 선택적 반사 기반 필터가 있음

컬러를 만드는 방법 (coloration)

백색광을 조명하고 파장을 선택적으로 투과 또는 반사 시키면 컬러를 만들 수 있음. 컬러 필터에서 우리가 특정 색깔을 볼 수 있는 이유는 그 색깔의 파장만 투과하고 나머지 파장은 반사 등으로 통과를 못 하기 때문임

파장을 조절하는 방법은 선택적 흡수 또는 나노미터 단위의 반복 구조로 반사시켜 조절할 수 있음. 선택적 흡수는 우리가 일반적으로 색깔있는 보석에서 나타남. 루비, 에메랄드 등. 이를 기반으로 하는 필터들도 있음

루비는 단단한 알루미늄 옥사이드에 크로미움이 불순물로 함유되어 있어 분홍 파장 이외 다른 파장 (초록, 파랑 등) 빛을 흡수하고 분홍 파장으로 형광을 내는 것임. 에메랄드도 베릴리움 불순물이 빨간색 빛을 흡수하고 나머지 파랑 녹색 빛을 투과시켜 색깔을 냄

구조적 컬러는 자연계에서도 많이 보이고 인공적으로 박막을 입혀서 만들 수 있는데, 이들은 빛의 파장보다 작은 서브 마이크론 또는 나노 미터 단위의 반복적인 구조로 구성되어 있음. 구조적 컬러를 내는 자연계 물질들은 박막이 층층히 쌓여 있는 조개 껍질 (마더 펄), 호랑나비 날개 (형형 색색의 패턴), 비틀 곤충의 표면 (초록색이면서 맨들맨들 함), 공작새 날개 등이 있는데 이들을 광학 현미경 또는 전자 현미경을 보면 빛의 파장보다 작은 구조가 반복되어 있어 반사되는 빛이 간섭을 일으켜 색깔을 냄 (보강간섭 하는 파장의 빛이 밝게 보이며 상쇄간섭하는 파장의 빛은 어두워져 색깔을 만듦)

구조적 컬러의 대표적 예는 비누 방울의 표면에서 반사되는 컬러풀한 빛과 컴팩트 디스크 등에서 반사되어 나오는 오묘한 컬러 빛 등이 있음. 비누 방울에서의 컬러는 얇은 물 층의 위와 아래서 반사된 빛이 서로 간섭하여 보이는 것임. water film의 윗면과 아랫면은 굴절율 차이로 반사가 일어나며 반사된 두 빛은 경로차가 얼마 나지 않아 서로 간섭함. 보강간섭 하는 파장은 강한 반사 빛을 만들고 상쇄간섭하는 파장은 빛이 사라져 특정 파장의 빛만 보이고 water film 의 두께에 따라 보강간섭 하는 파장 색깔이 변화함. 비누방울에서 충분히 얇은water film이 발생하는데 이는 비누가 물 분자의 표면 에너지를 낮춰서 퍼질 수 있게 했기 때문임

같은 방식으로 아발론 셀 조개 껍질에서도 색깔을 만듦. 매우 얇은 미네랑 층이 겹겹히 쌓여 반사되는 빛의 파장 중 특정 파장이 보강 간섭이 일어나게 해서 색깔을 발생시킴. 나비의 날개, 공작새 날개에서도 빛의 파장보다 작은 구조가 잘 배열되어 있어서 특정 파장의 빛이 보강간섭해서 강하게 반사됨. 투과되는 빛은 그런 색깔이 덜하고 주로 반사에서 발생함. 실리콘을 에칭해서 만드는 나노 필러도 에칭 과정에서 에칭 세기를 반복적으로 조절하면 나노 구조가 나타나고 같은 효과를 냄

컬러 필터

컬러 필터는 특정 파장 대역만 통과 시키는 광학 소자로 흡수 그리고 간섭 기반의 컬러 필터 두 종류가 있음

흡수 기반의 컬러 필터는 대표적으로 BG39 컬러 글래스 (스테인드? 글라스) 가 있음. Blue와 Green 파장은 통과 시키고 그 보다 장 파장인 Red, Infrared는 차단함. 가격이 싸고 성능이 좋음

간섭 기반의 컬러 필터는 더욱 다양함. 이는 유리 기판에 굴절율이 다른 박막 (파장의 1/4 또는 1/2 두께)을 층층히 쌓아서 만들 수 있는데 박막의 두께 그리고 굴절율을 조절하면 다양한 형태의 필터를 만들 수 있음. 예를 들면 일정 파장의 이상의 빛을 투과 시키는 long pass 필터, 반대로 이하의 빛을 통과 시키는 short pass 필터, 그리고 일정 대역의 빛 만을 통과시키는band pass 필터 등이 있음. 이들의 cut off wavelength도 조절할 수도 있음. 이들 필터는 광대역 파장의 광원에서 파장을 선택하거나, 레이저에서 원하지 않는 파장의 빛이 나오는 것을 차단하거나, 그리고 형광 현미경에서 파장이 서로 다른 여기광과 형광광을 분리, 형광광을 여러 분광 채널로 나눌 때도 사용함. 다양한 성능을 가지는 간섭필터가 판매되고 있으며 가격은 성능 지표와 대량생산 유무에 따라 넓은 범위를 갖고 있음. 일반적으로 흡수 기반의 필터보다 성능이 좋으며 가격도 비쌈. 이들을 만드는 기업은 샘록, 크로마 등이 있음

간섭 기반 필터의 원리는 특정 파장의 1/2 배 두께의 박막 (0.5 lamda) 의 양면에 얇은 메탈층을 붙인 경우를 생각해 볼 수 있음. 메탈층은 얇아서 일부 빛은 반사시키고 일부는 투과시킴. 여기서 투과하는 웨이브를 보면 (1) 바로 투과하는 웨이브가 있고, (2) 양쪽 메탈막에서 두번 반사한 뒤 통과하는 웨이브, (3) 다시 두번 더 반사 한 뒤 통과하는 웨이브 등이 있을 수 있음. 두번 반사한 뒤 통과하는 웨이브는 바로 통과한 웨이브에 비해 1 lamda 만큼 경로차가 발생함. 이들 통과한 웨이브들은 경로차가 파장의 정수배 이므로 서로 보강 간섭함. 그래서 통과하는 빛이 강할 것이고 반면에 반사되는 빛은 약할 것임. 다른 파장의 빛은 통과한 웨이브 들이 서로 보강 간섭하지 않으므로 통과 되는 빛의 양이 줄어들 것임. 그러므로 특정 파장의 빛만 100% 투과하고 다른 파장은 투과율이 낮을 것임

위의 경우는 특정 한 파장만 투과시키는 디바이스이고 실제 우리가 원하는 것은 low pass, band pass, 그리고 high pass filters 임. 이를 위해서는 RI 가 다른 박막을 여러층 쌓아서 특정 밴드에서 반사를 최소화 (반사되는 웨이브들 사이 상쇄간섭이 일어나도록) 하도록 만듦. 구체적인 디자인은 컴퓨터 시뮬레이션으로 할 수 있음. 이것의 예가 유리에 하는 anti-reflection coating (AR) 임. 유리는 공기와의 굴절율 차이로 각 면에서 약 4%의 반사가 발생함. 이 반사가 있으면 안경에서 상대방이 비춰질 수 있어서 안경을 쓴 사람의 눈을 볼 수가 없음. 이를 방지하기 위해 안경에는 가시광 대역에서 반사를 최소화 하는 AR 코팅이 되어 있음. 안경 표면이 약간 푸르스름 하게 보이는 게 코팅의 증거임

간섭 필터는 다른 흡수 기반 필터보다 cut off wavelength를 상대적으로 자유롭게 조절하고 또한 sharp transition 이 될 수 있도록 제작할 수 있음. 또한 한개의 밴드 패스를 갖는 게 아니라 여러개의 밴드 패스를 갖도록 조절할 수 있음. 이를 다중 밴드패스 (multi band pass) 필터라 함. 다중 밴드를 가지는 필터는 형광 현미경 영상에서 여러가지 (두가지 세가지) 형광 프로브를 동시에 사용해서 촬영할 때 유용함. 좀더 구체적인 스펙은 제작사의 홈페이지를 참조하길 바람

회절 격자 (diffraction grating)

회절 격자는 빛을 파장에 따라 분리하는 광학 소자로 분광 측정 또는 영상 등에 사용함

회절 격자를 만드는 가장 간단한 방법은 더블 슬릿이 아니라 멀티플 슬릿을 만들어 이 슬릿들에서 출발하고 회절된 빛 웨이브 들이 서로 간섭하게 하는 것임. 파장에 따라 보강 간섭하는 각도가 달라져서 파장에 따라 빛을 분산시킬 수 있음. 회절 격자 뒤에 렌즈가 하나 있어서 빛을 모은다고 생각하면 좋음. 먼저 0 광로차로 만나는 센터에서는 모든 파장의 빛이 보강간섭해서 백색광 스팟이 만들어 질 것이지만, 센터에서 벗어나는 위치 (각도)에서는 파장에 따라 보강간섭하는 위치 (각도, 경로차가 lamda 만큼 나는 위치)가 조금씩 달라 빛이 파장에 따라 분산됨. 이 분산은 두개의 슬릿에서도 발생하지만 슬릿 갯수가 많아지면 보강간섭 하는 위치 (각도)가 좀 더 샤프해 짐. 그래서 분광 측정의 해상도가 더 좋아짐

슬릿의 경우 빛 손실이 너무 많기 때문에 표면에 일정 패턴을 만들어 (블레이징) 사용할 수도 있음. 반복되는 톱니 모양으로 표면을 만들어 빛을 반사 시키면 일정 각도에서는 특정 파장이 보강 간섭하게 되며 각도와 파장의 관계식이 성립할 것임

반사 기반의 회절 격자도 있고 투과 기반의 회절격자도 있음. 이들의 원리는 마찬가지로 이들을 지나는 빛이 회절하고 각도에 따라 특정 파장의 빛이 보강간섭하여 분산시킬 수 있는 것임

간섭계 (interferometry)

빛을 이용하여 작은 변화 (small displacement, refractive index change) 등을 민감하게 측정하는 기법. 빛은 파장이 짧아서 작은 변화도 잘 감지할 수 있음

예를 들면 어떤 물체의 위치 변화를 알고 싶음. 이를 찾으려면 간단한 방법은 펄스 웨이브를 쏘고 반사되어 돌아오는 시간을 측정하면 알 수 있음. 이를 time of flight 라고 함. 레이다 등은 이 원리를 이용함. time of flight 를 감지할 수 있는 단위를 1 ps (10^-12 s) 라 하면, 빛의 속도는 3 x 10^8 m/s 이므로 감지할 수 있는 이동거리는 3 x 10^-4 m, 즉 0.3 mm 정도의 위치 변화를 을 감지할 수 있음. 이 것은 전자 장비의 한계로 볼 수 있음. 이를 위해서는 빠른 반응시간을 가지는 광센서, 이를 처리할 수 있는 전자회로 등이 필요함

그렇다면 이보다 더 작은 변화는 어떻게 측정할 까. 이는 간섭계를 사용하면 됨. 간섭계는 레이저를 광원으로 사용하고, 레이저에서 나온 빔을 두개의 빔으로 분리해서 각각 다른 경로로 보내고 돌아오는 두개의 빔들을 다시 결합시켜서 이들의 간섭 세기를 감지하는 광 센서로 이루어져 있음. 이 두개의 빔은 다른 경로를 거쳐 갔기 때문에 경로차가 있을 수 있고 이 경로차가 파장의 절반이 될 때 마다 상쇄간섭과 보강간섭을 반복할 것임

레이저에서 나온 빛을 분리해서 반은 시료로 보내 반사 시키고 나머지 반은 기준단에 있는 미러에서 반사시킴. 반사 되어 돌아온 두개 웨이브를 다시 결합시키고 이들의 간섭 상태를 감지함. 시료의 위치가 변하면 시료를 다녀온 빔의 경로 길이가 달라지고 기준단에서 오는 빛의 경로와의 경로차 변화로 간섭 상태가 달라짐. 간섭 상태의 변화가 0.5 lamda 마다 변화하기 때문에 너무 민감할 수도 있음. 하지만 변화가 이 구간 내에서 일어난다면 간섭 세기로 변화를 감지할 수 있으며 보강 상쇄 간섭을 한 주기로 본다면 주기 변화를 카운트 해서 lamda 단위의 변화도 측정할 수 있음

간섭계는 사물의 표면 거칠기 두께 등을 정확히 측정할 수 있음

간섭계를 사용해서 측정하려면 기준단이 안정적 이어야 함. 모든 측정은 기준단과 샘플단의 경로 차이로 발생하는 간섭을 감지하는 것 이므로. 안정적인 기준단을 만들기 위해 샘플단과 기준단이 거의 같은 경로를 거치도록 만드는 common path 방법도 있음

기준단과 샘플단의 경로가 거의 비슷해야 간섭이 잘 일어남. 레이저는 코히런트한 광원이긴 하지만 간섭을 일으킬 수 있는 경로 구간이 있음. 이를 결맞음 길이 (coherent length) 라고 함. 이 결맞음 길이는 레이저 종류에 따라 다르지만 수 백 마이크론에서 수 미터까지 있으며 이는 주로 파장 대역과 관계함. 파장 대역이 좁아야 결맞음 길이가 길어짐. 기본적으로 기준단과 샘플단 경로 길이가 결맞음 길이 구간 안에 있어야 안정적인 간섭을 관찰할 수 있음

간섭 상태를 파악하기 위해서는 기준단의 경로차를 좀 변화 시켜봐야 함. 즉 기준단의 한 위치에서는 결합된 광의 간섭 상태를 알기 어려움. 기준단의 경로를 변화시켜 (0, 1/4 lamda, 2/4 lamda, 3/4 lamda) 등으로 간섭을 일으켜 보면 어느 상태가 보강 간섭인지 상쇄 간섭인지 즉 위상 차이가 얼마나 난 것인지 알 수 있음. 위상 관계를 알기 위한 최소 측정은 0, 1/3 lamda, 2/3 lamda의 3회 일 것임

평행광 두개를 결합시켜 간섭을 일으키면 간섭 상태에 따라 전체적으로 밝기 변화가 발생함. 그런데 기준단을 기울이면 주기적인 간섭패턴이 발생되어 간섭 상태의 공간적인 정보를 알 수 있음

간섭에 대한 수학적 표현

현미경 영상 시스템에 대한 수학적 모델을 만들기 위해서는 빛과 간섭에 대한 수학적 표현이 필요함

특정 파장의 평행광은 cos (kz) 또는 sin(kz) 로 표현할 수 있는데 이를 복소형태로 표현하면 exp(j*k*z)가 됨

경로가 z, z+d_z 인 두개의 웨이브를 결합시키면 1*exp(j*k*z) + 1* exp(j*k*(z+d_z)) 가 되고 이 필드를 intensity 로 변환 시키려면 제곱을 구함. 그러면 2+2*cos(k*d_z) 가 나옴

같은 방식으로 기준단이 tilt 된 방향으로 진행하는 경우 각도를 alpha라 하면 kx 성분이 발생하는 데 이는 k*sin(alpha), kz 성분은 k*cos(alpha) 가 됨. exp[j*(k*sin(alpha)*x+k*cos(alpha)*z]

경로가 z+d_z 인 z 방향 샘플빔과 결합하면 exp[j*k*(z+d_z)]+exp[j*(k*sin(alpha)*x+k*cos(alpha)*z] 가 되고 intensity는 제곱해서 구하고 z 가 0인 경우에는 2+2*cos[k*(x*sin(alpha)-d_z)] 로 x 축에 따라 사인파 형태의 intensity 가 발생함

기하 광학

빛이 직진 (레이)하며 기하 법칙에 따라 굴절한다는 가정하에 빛의 진행을 추적하는 방법. 반사 및 굴절 법칙 하에 미러와 렌즈의 기능을 설명할 수 있음

기하광학에서 굴절 투과 등을 표현하기 위해 필요한 용어들. 1 surface normal: 면의 수직선. 입사각 굴절각을 표현하기 위함. 2. plan of incidence: 입사한 레이와 반사 굴절한 레이들이 이루는 면

반사 법칙: 반사되는 빛의 각도 (surface normal 기준) 는 입사각과 같음. 반사 법칙에 따라 전신을 비추기 위한 거울은 사람 키의 절반이면 된다는 것을 알 수 있음

굴절 법칙: 빛이 굴절율이 다른 물질로 입사하면 진행방향이 바뀜 (굴절함). 굴절각도는 입사각과 물질의 굴절율 (원래 진행하는 물질의 굴절율 n1, 입사하려는 물질의 굴절율 n2) 에의해 정해짐. n1*sin(theta1) = n2*sin(theta2)

굴절율은 물질 내 빛의 속도와 관계함. 굴절율이 높으면 빛의 속도가 느려지며 (v = c/n)이는 웨이브의 파장이 짧아진다는 것을 의미 (웨이브의 주파수는 그대로)

굴절 법칙은 파동 광학 (wave optics)로 유도 가능함. 어떤 물질에서 진행하는 빛이 다른 물질로 입사하면 파장이 달라짐. 파장이 변화한 상태에서 웨이브가 계속 진행하려면 웨이브 프론트가 꺾여야 함. 그러므로 진행하는 방향도 굴절함

완전 내부 반사 (total internal reflection, TIR). TIR 은 빛이 굴절율이 높은 물질에서 낮은 물질로 진행하려 할때 발생함. 이 경우 굴절각이 입사각보다 커 지는데 입사각이 일정 각도 이상이되면 굴절각은 90도를 넘어감. 이는 투과를 못한다는 의미 이고 투과가 없으므로 모든 빛이 반사하게 됨. 그래서 전반사라 함. 전반사 현상은 광섬유를 통한 빛의 전달에 활용됨. 광섬유는 빛이 지나다니는 core 코어 바깥에 굴절율이 낮은 물질로 코팅해서 cladding을 만듦. 그러면 빛이 전반사로 코어에 머무르게 할 수 있음. 물론 빛의 최초 입사각도가 전반사를 일으키는 임계각 이상이 되어야 함

클래딩 코팅 없이 유리막대 만 있다 해도 빛이 유리를 빠져 나오지 못하고 (공기나 물로 나오지 못하고) 전반사 하여 유리 안에 머물게 되지만 불순물이 유리막대 표면에 붙으면 빛이 타고 나올 수 있음. 이를 방지하기 위해 일반적으로 유리막대를 클래딩 코팅으로 덮음. 광섬유를 너무 구부리면 역시 빛이 새어 나오는데 이것도 같은 원리임

인터페이스에서의 반사와 굴절

굴절율이 다른 물질의 인터페이스를 지나갈 때 빛은 일부 반사하고 일부 굴절하면서 투과 함. 이는 빛이 파동이어서 나타나는 현상이며 (음파 등의 파동이 다른 물질로 들어갈 때 일부 반사하고 일부 투과하는) 기하광학으로는 설명하지 못함

반사와 투과의 비율은 맥스웰 방정식으로 계산할 수 있는데 이를 정리한 식이 프레넬 식 (Fresnel equations) 임. 반사와 투과 비율은 빛의 편광 상태에 따라 다른데 이는 인터페이스에서의 boundary condition이 달라지기 때문임

편광상태는 s, p 편광이 있음. 전기장 (진동축) 방향이 plane of incidence 안에 있으면 p 편광 (parallel polarization)이라 하고 전기장 방향이 plane of incidence 의 바깥으로 나오면 s 편광이라 함

s, p 편광에 따라 Fresnel equation 의 결과 식인 반사 및 투과 계수 (r, t) 가 다름. r_p, r_s 그리고 t_p, t_s 이들은 편광에 따라 다른 식으로 계산됨. 또한 반사 및 투과 계수는 입사각에 따라 달라지는데 입사각이 0도인 경우, 반사 및 투과 계수 (r과 t) 는 편광에 관계없이 일정함. 같은 식이 됨. 예를 들면 공기-유리 인터페이스에서는 반사세기가 4%, 96% 가 됨

편광에 따른 반사 투과 비율에 대해서는 나중에 편광을 배울 때 추가 설명하겠음

빛이 유리판을 통과할 때 발생하는 현상

유리판은 양쪽 면이 있으며 공기를 진행하는 빛이 각도를 가지고 유리에 입사하면 각 양쪽 인터페이스에서 굴절함. 첫번째 인터페이스에서 굴절각이 작아지고, 두번째 인터페이스에서는 굴절각이 다시 켜져서 결국 원래 입사각 그대로 진행함. 최종적으로 진행 방향는 그대로지만 통과한 빛의 광축은 원래 입사광의 광축에서 약간의 lateral shift 가 발생함

빛이 렌즈를 통과할 때 발생하는 현상

렌즈는 평행광을 굴절시켜 한 점에 모이게 함. 렌즈의 역할이 가장 잘 드러나는 경우는 입사광이 평행광 일 때임. 예를 들면 먼 곳의 태양에서 출발한 빛은 평행광이고 렌즈를 통과하고 나면 한 점에 모임. 즉 렌즈는 평행광 빛을 굴절시키는데 한 점을 통과하도록 굴절시킴. 반대로 초점에서 출발한 발산하는 빛은 렌즈에 의해 굴절하여 평행광이 됨. 이와같이 렌즈는 빛을 한 점에 모을 수도 있고 발산하는 빛을 평행하게 만들 수 있음

평행광을 한 점에 모은다는 것은 평행광 레이 위치에 따라 굴절 세기를 다르게 조절하는 것이라 볼 수 있음 (기하광학 기반의 설명). 렌즈 가장자리를 지나는 레이는 많이 굴절시키고 광축에 가까이 지나가는 레이는 덜 굴절시킴. 굴절은 입사각에 따라 달라지므로, 이를 위해 렌즈는 위치에 따라 입사각이 다르도록 곡면 경계면을 가지고 있음

이를 기하광학적 측면에서 보면 렌즈는 다른 굴절율을 가지는 물질로 이루어져 있고 평행광 레이의 위치에 따라 입사각을 다르게 함. 즉 광축에 가까이 지나가는 평행광은 입사각이 작고 광축에서 멀리 지나가는 평행광은 입사각이 커짐. 굴절 현상은 입사각이 위치에 따라 달라지도록 렌즈 면은 곡면으로 이루어 짐. 가장 대표적인 곡면은 구면인데 구면은 평행광 레이의 위치에 따라 입사각을 다르게 만들어 굴절세기를 달리 하고 한 곳에 모이게 함. 하지만 구면의 경우 광축에서 먼 곳에서는 굴절이 너무 세어 빛이 한 점에 모이지 않는 구면수차가 발생함. 그래도 구면 렌즈에서는 광축에서 너무 먼 곳까지 사용하지 않으면 초점이 만들어져 일반적으로 많이 사용됨. 그리고 구면 렌즈는 이상적인 비구면 렌즈에 비해 가격이 저렴한 장점도 있음

빛 레이는 렌즈의 양면에서 두번 굴절함. 렌즈의 한 면은 flat 할 수도 있음. 이 렌즈를 plano convex 렌즈라 함. 양쪽면이 convex 한 렌즈는 한쪽만 convex 한 렌즈에 비해 굴절파워가 더 높으며 double convex 라 함

렌즈에 의한 평행광이 굴절해서 한 점에 모이는 것을 wave optics 관점에서 설명할 수도 있음. 이 경우 평행광이 가지는 flat wave front가 렌즈에 의해 curved wave front 로 바뀜. 이는 lens를 지나가는 wave는 느려 지는데, 광축에 가까운 곳을 지나는 wave 는 두꺼운 부분을 통과하므로 더 많이 느려지고 광축에서 먼 곳을 지나는 wave 는 상대적으로 얇은 부분을 통과하므로 덜 느려져서 wave front 가 곡선이 됨. 그래서 직선이던 wave front 가 렌즈를 통과한 뒤에는 상대적인 느려짐으로 곡선이 됨. 렌즈를 지난뒤 형성된 curved wave front를 가지는 wave 들은 점차 모여서 한 점을 통과한 뒤 다시 발산함

렌즈 메이커의 식

렌즈 메이커가 렌즈를 만들 때 사용하는 공식으로, 렌즈의 초점을 구하는 또는 굴절파워를 계산하는 간단한 식. 굴절파워는 초점의 역수이며, 굴절파워는 재료의 굴절율과 공기 굴절율 차이에 비례하고, 곡률 (곡면 반지름의 역수)의 합에도 비례함. 즉 굴절파워 p = (n-1)* (1/R1 + 1/R2). 여기서 렌즈의 면은 구면으로 가정함

초점과 이를 측정하는 방법

초점이 짧으면 굴절파워가 높은 것이고 초점이 길면 굴절파워가 낮은 것임. 초점은 평행광을 입사했을 때 한 점에 모이는 곳 이므로 초점거리를 측정할 때는 멀리 떨어진 광원을 사용하면 됨. 태양을 광원으로 이용해도 되고, 천장의 전등도 렌즈의 초점거리에 비해 상대적으로 멀리 떨어져 있으므로 사용할 수 있음. 전등의 각 지점에서 출발하는 빛은 렌즈에 도달 할 때 평행광이라 볼 수 있음 (이 때는 천장이 좀 높다고 가정해야 함). 초점면에서는 전등의 각 지점이 초점에 맞아 전등 이미지가 만들어 질 것이며 전등 이미지가 만들어 지는 곳 까지의 거리가 초점거리 임

Convex/ Concave 렌즈

렌즈의 곡률에 따라 평행광을 굴절시켜 한 점으로 모을 수도 반대 방향으로 굴절시켜 발산 시킬 수도 있음. 한 점에 모으는 렌즈를 convex 렌즈, 발산 시키는 렌즈를 concave 렌즈라 함

렌즈 메이커 식에서 곡률 (curvature) 또는 곡률반경 (radius of curvature)은 양의 값을 가질 수도 음의 값을 가질 수도 있는데 거기에 맞춰 식이 구성되어 있음. 1/R1 - 1/R2 로 되어 있으며 양쪽이 convex 인 렌즈의 경우에는 첫번째 곡면의 반지름 R1은 양수, 두번째 곡면 반지름인 R2는 음수 (R2는 반대 방향에 형성됨)여서 실질적으로 더해짐.

반대로 양쪽면이 다 concave 인 double concave 렌즈의 경우에는 첫번째 곡면의 반지름 R1은 음수, 두번째 곡면 반지름인 R2 는 양수여서 실질적으로 더해지고 그 값은 -가 됨. 그러므로 렌즈 메이커 식은 convex 렌즈, concave 렌즈 모두에 다 적용될 수 있음

렌즈 분류

렌즈 양쪽 면에 따라서 convex 렌즈들도 double convex, plano convex, convex meniscus 렌즈로 분류됨. Double convex 렌즈의 경우 한쪽의 곡률은 +, 다른 쪽 곡률은 - 여서 렌즈 메이커 식에서 곡률이 더해지며, plano convex 렌즈의 경우 다른쪽 면의 곡률은 0 (R이 무한대) 가 되어 한쪽의 곡률로만 렌즈 파워가 생김. 마지막으로 convex meniscus lens 의 경우 두번째 면의 곡률도 +여서 첫번째 것에 대해 렌즈 파워가 빼 지지만 최종적으로 그래도 convex 파워를 가짐

Concave 렌즈도 같은 방식으로 double concave, plano concave, concave meniscus 렌즈들이 있음

실린더 렌즈

실리더 렌즈는 구면렌즈를 포함한 일반렌즈와 다르게 한쪽 방향만 곡면을 갖고 있어 평행광이 선 형태로 초점이 만들어짐. 일반렌즈의 경우는, 일반렌즈는 양쪽 방향 다 곡면이어서 평행광이 점으로 모임. 실린더 렌즈는 빛 시트 (light sheet)를 만들때 유용하게 사용할 수 있음

렌즈에 의한 이미지 형성

렌즈는 평행광을 받으면 굴절시켜 초점을 형성함

멀리 있는 사물의 각 포인트에서 출발한 빛은 일부가 렌즈를 통과하고 멀리 있는 경우 평행광으로 볼 수 있음. 각 포인트에서 출발한 빛은 초점 거리에 있는 면에서 초점을 형성하고 초점 면에서는 사물의 각 포인트에 대응되는 초점 포인트가 있으므로 사물의 이미지가 만들어 짐

상대적으로 가까운 곳에 위치한 사물도 렌즈는 이미지를 만들 수 있음. 각 포인트에서 출발한 빛은 발산하는데 렌즈는 이 빛 ray 들을 굴절시켜 다시 한 점에 모이게 할 수 있음. 이를 파악하는 방법으로 ray tracing 을 함. 사물의 각 포인트에서 출발한 빛 중에서 일부 빛 레이는 우리가 trace 를 할 수 있음. tracing 가능한 ray 들은 광축에 평행한 ray, 렌즈의 중심을 지나는 ray, 그리고 lens 의 front focus 를 지나는 ray 세가지가 있음. 이들 레이는 렌즈 이후 각각 back focus를 지나고, 굴절없이 직진하고, 광축에 평행해 짐

이들 세개의 ray 들은 서로 만나는데 이는 geometry 로 확인 가능함. 서로 만나는 점이 위치하는 거리가 이미지 면의 거리가 되며, 확대비율도 이미지 면의 거리/ 사물의 거리로 파악할 수 있음

렌즈의 초점거리가 정해져 있으면 사물의 위치에 따라 real image 가 만들어 지거나 virtual image 가 만들어 지며 확대비율이 달라짐. 예를 들면 사물이 초점거리에 비해 아주 멀리 있다면 de-magnified image가 만들어 지며, 1배 이미지는 사물이 초점거리의 2x 위치 (2f)에 있을 때임. 적절한 양 만큼 굴절하므로 이미지가 만들어 지는 위치가 렌즈 뒷면 초점거리 2x 위치 (2f)에 발생함

확대 이미지는 사물이 2f 와 1f 사이에 있을 경우임. 확대비율은 사물이 1f 위치 즉 초점에 가까이 오면 더 커짐. 사물이 1f 위치에 있는 경우 렌즈에 의해 굴절한 빛은 평행 ray 가 됨. 이 렌즈 만으로는 이미지가 만들어 지지 않고, 추가되는 렌즈가 평행광을 받아 이의 초점위치에 이미지를 만들 수 있음. 사물이 1f 안쪽에 있는 경우 렌즈로 굴절 시켜도 발산을 멈추지 못함. 발산하는 레이는 마치 렌즈의 어떤 지점에서 출발한 것으로 볼 수 있고 이를 virtual image 위치라고 함. virtual image도 배율이 있어 눈으로 확대된 이미지를 볼 수 있음

사물의 위치에 따라 (초점거리에 상대적으로) 이미지의 위치가 달라지며 이 것은 기하 분석을 통해 알 수 있음. 이를 정리한 식이 이미지 형성 식임. 사물의 위치를 a, 렌즈의 초점거리를 f 라 하면 이미지의 위치 b 는 다음과 같은 식으로 알 수 있음. 1/a + 1/b = 1/f

그리고 확대 비율 M 은 b/a 임 (M = b/a)

일전에 이야기 했듯이 현대 현미경에서 사물에 대한 확대 이미지를 만드는 방법은 초점거리가 짧은 대물렌즈를 사용하는데 사물을 대물렌즈 초점거리에 둠. 그러면 사물을 각 포인트에서 출발한 빛은 대물렌즈에 의해 평행광이 됨. 이 평행광을 받아서 튜브렌즈가 이의 초점에 이미지를 형성함. 이런 방식은 대물렌즈와 튜브렌즈 사이에서는 빛이 평행광 이어서 사이 거리가 매우 정확할 필요는 없게 됨. 그리고 대물렌즈는 수차교정이 필요한데 대물렌즈에 의한 이미지가 무한대에 위치한다는 가정하에서 수차가 교정 되어 있음

렌즈의 수차 (aberration)

이상적인 렌즈와 달리 실제 렌즈는 여러 수차를 가지고 있어서 이상적인 초점 또는 이미지를 만들어 내지 못함

수차는 크게 on axis aberration 과 off axis aberration으로 나뉘어 짐. on axis 수차는 은 광축에 위치한 지점에서도 발생하는 수차를 의미하고 off-axis 수차는 광축에서는 발생하지 않으나, 광축에서 벗어난 위치 (이미지의 관점에서는 이미지의 가운데가 아니라 주로 가장자리 위치)에서 발생하는 것들을 의미함

광축에서 발생하는 수차로는 구면수차 (spherical aberration)와 색수차 (chromatic aberration)가 있으며 이들은 먼저 교정되어야 하는 수차임. 광축 바깥에서 발생하는 수차로는 coma, astigmatism, image field distortion 등이 있음

구면수차 (spherical aberration)는 렌즈 곡면이 구면이기 때문에 발생하는 수차로 광축에서 먼 곳에서 입사하는 평행광이 굴절이 너무 강해서, 광축 근처에 입사하는 평행광 ray 에 의해 만들어지는 초점 보다 일찍 만들어 지는 현상임. 구면수차를 피하는 방법으로는 구면 렌즈 대신 이상적인 곡면을 가지는 aspherical lens 를 사용하거나, 구면렌즈를 사용할 때도 aperture 를 제한해서 사용하면 됨. 일반적인 렌즈는 구면렌즈 이므로 aperture를 제한해야 하는데 rule of thumb 으로 초점거리의 1/2 정도가 적합함. 즉 렌즈의 초점거리가 50밀리미터인 1인치 렌즈의 경우에는 아퍼처를 약 1/2 초점거리인 25 밀리미터 이하로 제한하는 것이 좋음

다른 구면수차를 줄이는 방법으로는 double convex 렌즈를 사용하지 말고 plano convex 렌즈를 사용하는 것임. Plano convex 렌즈는 굴절 파워가 상대적으로 작지만, 따라서 구면수차도 상대적으로 작음. Plano convex 렌즈는 방향성이 있으며 (한쪽은 curved surface 이고 다른쪽은 flat surface 이어서) 적절한 방향으로 사용하는 것이 필요한데 rule of thumb 은 평행광이 curved surface 를 만나게 하는 것임. 이렇게 하면 curved surface와 flat surface 둘다 굴절을 일으키며 굴절파워가 분산되어 수차를 줄일 수 있음

굴절파워가 더 필요한 경우 여러개의 약한 굴절파워를 가지는 렌즈를 조합해서 사용하는 것이 하나의 큰 굴절파워를 가지는 렌즈를 사용하는 것 보다 더 나음

색수차 (chromatic aberration)는 렌즈의 굴절율이 파장에 따라 변하기 때문에 생기는 수차임. 렌즈는 유리로 주로 만들어 지고 굴절율이 약 1.5 로 알려져 있지만, 굴절율은 파장에 따라 미세하게 달라짐. 파장이 짧아지면 굴절율이 증가하며, 굴절파워가 더 높아짐. 그래서 가시광 중에서는 파란색 광은 더 짧은 초점위치에 초점이 만들어지고 빨간색은 초점위치가 더 길어짐. 이를 이미지에서 보면 어느 파장에서 초점을 맺는 면을 선택한다면 다른 파장의 빛은 초점이 아니므로 색 번짐이 관찰됨

색수차는 백색광을 사용해서 이미징 할 때 문제가 됨. 예를 들면 태양광 할로겐등 등을 사용할 때. 그래서 고배율로 이미지를 확대해도 이미지가 선명하게 만들어 지지 않아 자세한 관찰이 어려웠음. 색수차 문제는 1600년대 고배율로 확대할 수 있는 렌즈가공 기술이 개발되며 현미경이 처음으로 사용되었을 때 대두된 고질적 문제였음. 이후 색수차를 해결하는 방법이 개발되었고 고배율로 확대하여도 색수차 문제 없이 선명하게 관찰할 수 있었음

색수차를 해결하는 방법은 achromatic doublet 렌즈를 사용하는 것임. 이 더블렛 렌즈는 서로 다른 유리 재료로 만든 double convex 렌즈와 plano concave 렌즈 두개를 투명 시멘트로 붙인 것으로 각 렌즈에서 발생한 색수차 영향을 서로 상쇄하는 효과가 있음. Double convex 렌즈는 crown glass로 plano concave 렌즈는 flint glass 로 만드는데, flint glass 는 굴절율이 좀더 심하게 변화하면서 네거티브 렌즈여서 crown glass 로 된 포지티브 렌즈의 색수차를 상쇄할 수 있음

또 다른 방법으로는 굴절율이 가시광 대역에서 거의 일정한 fluorite glass를 사용하는 것임. 이를 사용해서 만든 대물렌즈를 fluorite 렌즈라고 함

색수차는 유리의 굴절율이 일정치 않아서 발생하는 현상이지만 이를 활용하여 분광에 사용하는 광 소자가 있는데 이것이 프리즘임. 프리즘은 flint 유리와 같이 굴절율이 파장에 따라 급격히 변화하는 재료로 만드는데 빛이 굴절하면서 파장에 따라 다른 방향으로 굴절함. 프리즘은 삼각형 모양으로 만들어서 굴절각이 큰 파란색 파장이 유리 내에서 많이 진행해서 파장에 따라 빛의 경로가 차이가 나게 만듦. 분광에는 프리즘 이외 회절 격자를 사용하는데, 프리즘은 상대적으로 분광 파워가 좀 약한 편이고 더 강한 분광파워가 필요할 때는 회절격자를 사용함

코마는 off axis 수차의 대표적인 현상으로 사물이 광축에서 벗어나 있을 때 발생함. 사물에서 출발해서 렌즈의 중심을 지나는 빛은 특정 입사각 (0도가 아닌)을 가지고 있으며 그 고정각을 기준으로 + alpha 그리고 -alpha 각을 가지고 진행하는 ray는 렌즈에서 굴절을 달리 하고 최종적으로 이 ray 들은 한 점에 모이지 않음. 그래서 이미지에서 보면 점 퍼짐 함수 (point spread function)가 꼬리를 갖고 나타남. 그래서 행성 형태여서 코마라고 명명함

Astigmatism은 역시 off axis 수차의 현상인데 off axis point에서 출발한 빛 ray 들 중, x축 그리고 y축을 따라 진행한 ray 들에 대한 보이는 curvature 가 달라짐. 즉 광축이 z 축이라 하면 렌즈는 x 축, y 축 방향에 따라 굴절 세기가 다름

이것과는 좀 다르긴 하지만 눈에서는 각막이 완전히 대칭이 아니라 한쪽 축 방향 (x축 y축, 또는 x + alpha, y + alpha 축)이 곡률이 크고 반대쪽 축에서는 곡률이 상대적으로 작아 on axis 포인트에서 출발한 빛 ray 들도 한 점에 모이지 않게 되고 이를 난시라고 함. 엄밀히 말해서 각막에서의 난시는 각막이 대칭적인 곡면이 아니어서 발생하는 것이며, off axis aberration은 아님. 난시는 안경으로 교정할 수 있음. 안경을 처방할 때 두개의 curvature (또는 디옵터)를 표시하거나 한 방향의 curvature 가 얼마이고, 90도 방향의 curvature가 얼마나 차이가 나는지 표시할 수도 있음

Image distortion은 다양한 형태로 발생함. 먼저 초점 면이 flat surface 가 아니라 curved surface인 경우를 field curvature라고 하며, 확대비율 (magnification) 이 off axis 지점에 따라 달라지는 것에 따라 barrel distortion, pincushion distortion이라 부름

결국 단일 렌즈에서서는 이러한 다양한 수차가 있으므로 고해상도 이미지를 얻지 못함. 그래서 이러한 수차를 교정해야 하며 대물렌즈는 여러 렌즈들을 결합한 복합렌즈이며 수차를 교정할 수 있음. 수차 교정 수준에 따라 대물렌즈의 클래스가 달라짐

대물렌즈 클래스

대물렌즈는 짧은 초점거리와 높은 NA가 요구되는 특수렌즈로 수차에 매우 민감함. 이는 대물렌즈가 사물 가까이 붙어서 사물에서 출발하는 발산광을 잘 수집해야 확대된 이미지를 형성할 수 있기 때문임

그래서 대물렌즈는 수차교정을 위해 렌즈가 여러개로 구성된 복합렌즈이며 수차교정 레벨에 따라 여러 클래스로 나뉘어 짐

대물렌즈 클래스는 Achromats, Fluorites, Apochromats, Plan-apochromats 등이 있으며 Fluorite 를 제외하면 이름이 길어질 수록 수차교정이 많이 들어간 것으로 보면 됨

Achromats 는 두개의 가시광 파장에서 색수차가 보정된 대물렌즈임. 이와 함께 중간 파장의 구면수차도 보정되어 있음

Apochromats 는 RGB, dark blue 네가지 가시광 파장에서 색수차가 보정되어 있으며 GB 두 파장에서 구면수차도 보정되어 있음

Plan-apochromats 는 field curvature가 보정되어 카메라로 이미지를 획득하는 데 최적화 되어 있으며 현재 the best available 임

Fluorites는 파장에 따른 굴절율 변화가 작은 fluorite 유리로 만든 대물렌즈로 구조가 상대적으로 단순하면서 가격대비 성능이 좋음. NA를 크게 만들 수 있어서 해상도가 좋은 이미지를 얻을 수 있음

대물렌즈 클래스를 보면 주로 색수차 교정과 구면수차 교정에 집중되어 있으며 최고가의 경우 flat field를 가지고 있어 표면이 flat 한 카메라 이미징에 적합함

대물렌즈 정보

복합 렌즈인 대물렌즈의 배럴에는 여러 정보가 각인되어 있음. 간단한 정보로 대물렌즈 클래스, 배율 등이 있으며 이 이외에 침지식 렌즈 유무, 침지 미디어, 커버슬립 유무, 작동 거리 (working distance, WD), 산술구경 (numerical aperture, NA) 정보 등이 있음

대물렌즈의 중요 정보 중 하나가 산술구경 정보임. 산술구경은 샘플에서 발산하는 빛을 획득하는 각도를 의미하는데 수식으로는 n * sin(theta) 임. 여기서 광축 기준 최대각도가 theta 이며 n 은 immersion medium 의 굴절율임. 에어 렌즈의 경우는 1, 워터 또는 오일 침지식 (immersion)의 경우에는 1.33과 1.5가 사용됨

산술구경은 왜 중요한가? 산술구경은 점퍼짐 함수 (PSF) 크기를 결정하는 인자여서 해상도와 직접 관련이 있음. 같은 배율을 가지는 현미경 대물렌즈도 산술구경이 달라질 수 있음. 산술구경은 PSF 크기를 결정함. PSF 는 점광원에서 출발해서 대물렌즈에 의해 수집된 light wave 들이 형성하는 점 퍼짐 함수 (포인트가 분산된) 이미지 인데, PSF 크기는 센터의 peak intensity 지점에서 벗어나면서 wave 들의 상쇄간섭으로 발생하는 dark ring 의 위치로 파악할 수 있음. 산술구경이 크면 PSF 의 첫번째 dark ring의 반지름이 작아짐. 이는 중심점에서 조금만 벗어나도 웨이브들끼리 상쇄간섭을 일으킬 수 있다는 것을 의미함

점광원을 시료로 할 때 얻어지는 현미경의 점광원의 이미지는 PSF에 배율이 곱해진 것임. 그러므로 배율은 PSF 크기에 영향을 미치지 않음. 만일 1배 배율을 가지는 이미지를 만들려면 빛 수집에 사용한 같은 대물렌즈를 뒤집어서 튜브렌즈로 사용하면 되며 이것이 PSF 에 해당됨. 만일 초점거리가 다른 튜브렌즈를 사용해서 이미지를 만들면 1x 이상의 배율을 가지게 되는 것이고, 이 경우에는 PSF 형태는 변하지 않고 그냥 확대된 것임. 그러므로 빛을 수집하는 대물렌즈의 산술구경이 해상도를 결정함

PSF 를 결정하는 공식은 단일슬릿의 회절무늬 공식과 같음. 단일슬릿의 경우 첫번째 dark ring의 위치가 슬릿의 너비 (w), 스크린까지의 거리 (d) 등의 함수로 구성되어 있는데 이들을 산술구경으로 정리할 수 있으며, 이를 정리하면 0.5*lamda/NA가 됨. 이 것은 슬릿 기반 공식이므로 대물렌즈가 square 형태의 aperture를 가질 때 활용할 수 있는 공식임. 실제 대물렌즈는 disk 형태의 aperture 를 가지므로 해상도 공식이 좀 바뀌어, 0.61*lamda/NA 가 됨

해상도는 PSF 의 센터에서 첫번째 다크 링까지의 거리 (PSF 의 반지름)이 결정함. 이는 두개의 포인트 광원의 이미지를 만들때 각 포인트는 PSF를 형성하고 두개의 포인트를 가까이 접근시키면 PSF가 서로 중첩하는데, 두개의 포인트가 resolve 되는 가장 가까운 거리는 하나의 PSF의 dark ring 이 다른 PSF 의 센터에 있을 때가 됨

immersion lens 그리고 immersion medium 에 관한 정보도 렌즈 배럴에 각인되어 있음. immersion lens라 함은 렌즈를 immersion medium에 담궈서 렌즈와 샘플 사이 공간이 immersion medium 으로 채워지는 경우를 의미함. 이렇게 하면 샘플에서 출발한 빛이 렌즈에 도달할 때 까지 immersion medium을 통과하므로 파장이 짧아지고 해상도가 좋아짐. NA = n*sin(theta)

Cover slip 의 유무. 일반적인 대물렌즈는 샘플에 커버슬립을 씌우고 사용함. 특수 대물렌즈 중에는 cover slip 을 사용치 않는 렌즈가 있음

Working distance (WD)는 대물렌즈의 끝 부분에서 샘플까지의 거리를 의미함. 대물렌즈의 배율이 정해지면 focal length는 결정되지만 실린더 형태의 복합렌즈에서 렌즈의 기준점은 불명확함. 대신 WD 는 정확히 정해질 수 있으며 일반적으로 focal length 보다 훨씬 짧음. WD는 시료를 3차원 이미징 할 때 커버슬립 위치에서 시료 안에 얼마나 깊이 들어갈 수 있는지를 나타내는 지표임

대물렌즈의 배율과 해상도

대물렌즈의 배율과 해상도는 사실 직접적인 관계가 없음. 하지만 배율이 높은 대물렌즈는 더 좋은 해상도가 요구되므로 (확보되어야 하므로) 산술구경이 커지는 경향이 있음. 즉 다시 말하면 해상도는 산술구경에만 관계함

침지식 대물렌즈의 필요성 (장단점)

침지식 대물렌즈는 산술구경을 증대할 수 있으며 전반사를 막을 수 있는 장점도 있음. 산술구경이 증대하는 이유는 파장이 짧은 상태에서 빛을 모을 수 있기 때문임 (침지 미디어 에서는 파장이 짧아 짐). 그래서 산술구경에 침지 미디어의 굴절율 n이 곱해짐. n*sin(theta)

침지 미디어는 샘플의 굴절율과 맞추는 것이 좋으며 커버슬립을 사용하는 경우 이를 고려하는 게 좋음. 커버슬립을 사용하면서 샘플의 표면에서 출발하는 빛을 모으는 경우에는 커버슬립과의 굴절율 매칭을 위해 오일 침지식 렌즈가 적절함. 만일 샘플 깊숙한 곳에까지 촬영하는 공초점 현미경의 경우 샘플 굴절율을 고려해서 워터 또는 오일 침지식을 선택하는 것을 추천함. 이는 굴절율 불일치로 발생하는 구면수차를 최소화 하기 위함임. 샘플에 따라 물과 오일 사이의 굴절율을 가질 수 있는데 이 경우 글리세린 침지식 대물렌즈를 사용하거나 조절가능한 대물렌즈를 사용할 수도 있음

침지식 렌즈의 경우 해상도를 향상시키고 수차를 최소화 할 수 있는 장점이 있으나 침지를 유지해야하는 요구조건도 만족해야 함. 오일 침지식 대물렌즈는 일반적으로 working distance가 짧음. 이는 오일의 표면장력이 작아서 잘 유지되지 않기 때문임

커버슬립을 사용하는 대물렌즈?

일반적인 대물렌즈는 커버슬립을 씌운 샘플을 촬영하도록 디자인되어 있음. 즉 커버슬립이 대물렌즈와 샘플 사이에 있어 샘플을 분리함. 커버슬립의 두께는 약 0.17 밀리미터 정도 이며 이를 No 1.5라고 칭함. 커버슬립을 사용하는 대물렌즈는 일반적으로 No1.5 커버슬립을 사용함

커버슬립 없이 샘플 미디어에 침지하는 렌즈가 있는데 이 경우 깊이 3차원 촬영해도 구면수차 등의 영향이 없음

푸리어 광학

광학 영상에서 light wave 의 전파와 회절 이미지 형성 그리고 렌즈에 의한 이미지 형성 등을 푸리어 변환으로 설명하는 방법

한 평면에서 light field 정보는 wave front로 알 수 있음. 이 wave front 정보는 특정 방향 (k 벡터)을 가지는 flat wave front들의 조합으로 파악할 수 있음. 즉 arbitrary wave front 를 가지는 단일파장의 light field 는 flat wave front 를 가지는 (k 벡터가 크기는 같지만 방향은 다른) light field 로 분리할 수 있음

이렇게 plane wave 들로 분리해 내면, 각 plane wave들은 z 거리 만큼 전파하면서 plane wave 를 유지하면서 위상만 바뀌므로 z 위치에 있는 light field는 이들을 다시 조합하여 알 수 있음. 이를 통해 간단한 형태의 전달함수를 구할 수 있음

푸리어 변환은 어떤 신호 또는 2차원 공간 신호 정보 (이미지) 를 주기함수 (공간 주파수 별로) 들로 분리하는 방법임. 이렇게 분리하고 나면, 각 공간 주파수 성분을 가지는 주기함수는 해당되는 kx, ky 성분을 가지는 k 벡터의 plane wave 에 해당됨. 즉 사물 평면에서 각 plane wave 들은 주기함수 (harmonic function) 을 만들어 냄

작은 슬릿에서 출발한 light field 가 먼곳에 있는 스크린에 전파되면 마치 이를 구성하는 light wave 들이 많이 퍼지게 되는데, 스크린에 만들어지는 light field 는 원래 슬릿 소스 필드의 푸리어 변환에 해당됨

Front focal plane 초점면에서 출발한 light field 가 렌즈를 통해 back focal plane 초점면에 도달하면 렌즈 전의 각 plane wave 가 렌즈 후에서 초점을 형성해서 이 두 초점 면 사이에서도 푸리어 변환 관계를 가짐

에어리 디스크 또는 점 퍼짐 함수의 경우 font focal plane 에 있는 평면파가 진행하면서 렌즈의 aperture 에 의해 잘려 생기는 light field 가 변환 된 것이라 볼 수 있음. 그러므로 점 퍼짐 함수는 렌즈 아퍼처로 제한된 flat field 의 푸리어 변환이라 볼 수 있음

수차는 렌즈의 aperture에 도달한 wave 가 flat 하지 않은 wave front 를 가지기 때문에 발생함. 이 상태에서 푸리어 변환을 하면 수차를 가지는 점퍼짐 함수 (point spread function, PSF) 를 계산으로 구성할 수 있음

현미경 영상화에서 회절 현상

현미경 영상화에서 회절은 해상도를 결정하는 중요한 현상임

샘플에 있는 작은 구조들은 각자 작은 폭을 가지는 슬릿이라고 생각할 수 있음. 구조가 작으면 작을 수록 회절에 의한 빛 웨이브의 정보 퍼짐이 더 강해짐. 작은 구조는 더 큰 각도로 회절함. 극단적으로 점 광원은 모든 각도로 정보를 퍼뜨림

현미경은 이렇게 샘플 구조에 의해 방향이 변경된 (회절된) 빛 웨이브를 수집하고 전달해서 샘플에 대한 확대 이미지를 만드는 기기임. 빛 웨이브를 수집할 수 있는 능력은 대물렌즈의 산술구경에 의해 결정됨. 즉 포인트 광원에서 출발한 발산광을 대물렌즈 산술구경 만큼 수집해서 이미지를 만드는 것임

단일 슬릿에서의 회절 패턴과 렌즈 초점에서 회절 패턴의 유사점

단일 슬릿에서 멀리 떨어진 스크린에서 발생하는 회절 패턴은 단일 슬릿을 통과한 평면 파 일부 (슬릿의 너비에 의해 제한된) 의 wave front 각 점에서 출발한 구면파가 먼 거리를 전파하면서 평면파로 변하고, 이들 평면파들이 스크린에서 조합하여 만들어 냄

렌즈의 경우도 평면파가 렌즈를 통과하면서 curved wave front 를 만들고 그 wave front 에 있는 각 점에서 발생하는 웨이브들이 초점 면에서 서로 결합하고 간섭해서 만들어 내는 데, 이 각 포인트에서 출발해서 초점을 지다는 웨이브는 평면파로 볼 수 있어서 사용하는 공식이 같음. first dark ring 까지의 거리는 0.61*lamda/NA 로 단일슬릿에서 만들어내는 회절 필드와 공식이 같음

렌즈 초점에서의 회절 패턴 크기 구하는 법 - 포인트 늘리기 방법에 대한 설명

렌즈 초점에서 회절 패턴의 크기는 점퍼짐 함수라고도 하며 아래의 식에서 구할 수 있음. 0.61*lamda/NA

여기서 NA 는 렌즈의 산술구경을 나타냄. 회절 패턴은 렌즈의 산술구경과 반비례 해서 산술구경이 커지면 회절 패턴이 작아지고 해상도가 좋아짐

flat wave front 를 가지는 웨이브가 렌즈를 지나면 curved wave front로 변경됨. Wave front 상에 있는 모든 포인트 들이 wavelet 을 발생시켜 점퍼짐 함수를 만드는데 점퍼짐 함수가 만들어 지는 과정을 포인트를 늘려가면서 분석해 볼 수 있음

회절 패턴이 wave front 의 모든 포인트들이 기여해서 만드는 간섭 무늬이지만 이 경향성은 렌즈 구경 양끝에 위치한 두 포인트가 만드는 간섭 무늬에서 시작해서 포인트 들을 늘려가면서 일어나는 현상으로 이해할 수도 있음

더블 슬릿에서의 회절 패턴은 경로차가 0, +/- 1*lamda, +/- 2*lamda 마다 피크가 발생함. 이것은 curved wave front 가장자리 포인트 두개에서 출발한 웨이브의 조합으로 볼 수 있으며 주기적인 패턴을 만들어 냄

만일 curved wave front 내에서 센터 포인트까지 포함해서 3개의 포인트에서 발생하는 웨이브들이 조합한다면? 두개의 포인트 소스로 만들어진 주기적인 패턴 중에서 가운데 피크는 그대로 유지되지만 그 다음 피크는 좀 달라짐. 왜냐하면 세개의 포인트가 함께 in phase 로 만나는 점은 좀 더 줄어들 것이므로

포인트 갯수를 늘려서 5개의 포인트에서 발생한 웨이브들의 조합에서는? 가운데 피크는 그대로 유지되지만 가운데 것의 다음 피크는 점차 in phase가 되지 않을 듯. 이런식으로 해서 가운데 피크를 제외한 나머지 피크들은 크기가 점차 줄어듦. 그래서 결국 가장자리 두개의 포인트가 만들어낸 피크 조합 중에서 가운데 것만 살아남게 됨

이로서 wave front 상에 있는 모든 포인트에서 발생한 웨이브 들의 조합으로 만들면, 가운데 피크 만이 살아 남을 것이고 이 피크의 폭은 대체적으로 처음 두개의 포인트가 만들어 낸 것 보다는 좀 넓어 지더라도 크게 변화하지 않을 것임. 그러므로 결국 산술구경이 큰 렌즈가 만드는 점 퍼짐 함수가 사이즈가 더 작을 것임

축 방향에서의 회절 패턴 분석, 3D PSF, depth of focus

렌즈로 형성된 점 퍼짐 함수 또는 회절 패턴은 3차원적으로도 분석 가능함. 위에서 분석한 점 퍼짐 함수 또는 회절 패턴은 광축 (z)의 수직한 이미지 면 (x-y)에서 분석한 것임. 그렇다면 광축을 따라서는 어떻게 되는가? 광축을 따라서 점 퍼짐 함수 형태는 초점이 유지되는 축방향 거리 분석에 필요함 (초점 유지 깊이 영역 또는 depth of focus)

초점 위치에서는 모든 웨이브가 진행거리가 같아서 in phase로 만나지만, 초점 위치에서 delta_z 만큼 떨어지면 거기서도 웨이브들 끼리 out phase가 발생함. 즉 aperture의 가장자리와 중심에서 출발한 웨이브 쌍을 비교해 보면, 진행거리가 zf + delta_z 위치에서는 중심에서 출발한 웨이브는 delta_z 경로가 더 늘어났고, 아퍼처의 가장자리에서 출발한 웨이브는 delta z*cos(theta) 만큼 경로가 길어져서 이들의 경로 차이는 1-cos(theta) = theta^2/2 가됨. 즉 out phase 가 되는 지점은 delta_z* theta^2/2 가 lamda/2 이 되는 점이고 delta_z 가 out phase가 되는 지점은 theta 의 제곱에 반비례 함 (즉 NA 제곱에 반비례 함). 이는 lateral 방향에서 dark ring 의 위치가 NA의 일제곱에 반비례 하는 것과 차이가 있음. z 축 방향에서의 점 퍼짐 함수의 크기는 NA 에 더 민감하게 반응함 (한쪽은 NA에 반비례 다른쪽은 NA 제곱에 반비례)

특정 NA 에서 점 퍼짐 함수를 x-z plane 에서 그려보면 미국 풋볼 공의 형태가 됨 (즉 축방향으로 더 김). 점 퍼짐 함수의 first dark ring의 위치를 계산해 보면 NA가 1이고 파장이 0.5 마이크론일 때 r0 와 z0가 약 0.3 과 1 마이크론 임 (즉 축방향으로 더 김). xy 평면에서 촛점이 유지되는 풋볼 영역의 축방향 거리를 depth of focus 또는 depth of field 라 하고 약자로 DOF 로 사용함. NA가 1일 때 depth of field는 2*z0 즉 약 2 마이크론 정도 됨

만일 NA가 10배 줄어들어 0.1 이 된다면 r0와 z0는 어떻게 될까? 0.1 NA 에서는 r0는 10배 늘어 0.3 마이크론에서 3 마이크론으로 커질 것이며, z0는 10배의 제곱, 100배가 늘어 1 마이크론에서 100 마이크론이 될 것임. 이는 이들의 크기와 NA와의 관계가 다르기 때문임 (하나는 NA에 반비례, 나머지는 NA 제곱에 반비례) 즉 DOF 는 약 200 마이크론이 됨

F-number

F-number는 카메라에서 사용하는 용어로 산술구경과 관계가 있음. 카메라에서는 초점 심도를 조절하기 위해 카메라 렌즈 조리개를 열었다 줄였다 하는데 , F-number 는 조리개의 지름 (너비)가 초점거리에 비해 얼마인지를 나타냄. F-number 는 초점거리와 관련 시켜 f/xx 로 표현함. 즉 f/1.4 라 하면 D가 f/1.4, f/8 이라 하면 D가 f/8 사이즈라는 것임. f 넘버는 f/xx 에서 xx 만을 표시해 놓은 거라 f 넘버가 크면 조리개가 많이 줄어들었다고 생각할 수 있음

카메라에서 조리개를 열면 f number는 줄어들고 (f/xx 에서 xx 값이 줄어 듦) 초점 심도도 줄어듦. 조리개를 좁히면 f 넘버는 커지고 초점심도도 길어짐. 그러므로 F-number 와 초점심도는 비례관계에 있음. 물론 선형 비례는 아니고 비선형 비례? ㅋㅋ 물론 조리개를 좁히면 광량이 줄어들어 어두워지게 되며 그래서 노출 시간을 길게 갖고가야 함.

해상도 제한을 극복하는 방법

현미경 영상에서는 렌즈 아퍼처의 빛 수집 제한 때문에 포인트가 퍼져서 보임. 일반적으로 파장에 절반 정도 되는 크기의 사물구조 만을 관찰할 수 있음. 해상도를 향상시키는 방법으로는 간단히 대물렌즈 산술구경을 키우거나 영상화 하는 조명광의 파장을 짧게 하면 됨. 대물렌즈 산술구경은 최대 0.95 로 제한 되므로 침지 미디엄을 사용해서 키울 수도 있음. 1.4 또는 1.5. 그 다음 단계는 짧은 파장의 조명광을 사용하는 것임. 이를 실제 반도체 노광공정에서는 사용하고 있으며 극초자외선 파장을 사용해서 선폭을 줄이고 있음. 최근 개발되는 장비에서는 13.5 나노미터 자외선 (x 선 파장인가?)을 사용하고 비선형 현상들을 추가해서 2-3 나노미터 선폭을 구현함

바이오 샘플에서는 샘플에 의한 수차 교정과 초고해상도 현미경 기술로 해상도를 향상 시킬 수 있음. 샘플을 3차원 영상화 하는 경우 샘플의 굴절율이 침지 미디어 또는 에어 렌즈의 굴절율과 다를 수 있고, 샘플의 표면이 불규칙 해서 wave front 교란이 일어날 수 있음. 이 경우 wave front 를 교정할 수 있는 변형거울 또는 spatial light modulator (SLM) 등을 사용해서 교정해서 샘플에 의한 수차영향을 제거할 수 있음. 이를 위해서는 wave front 을 측정하거나 추정해야 하는데 측정하는 방법으로는 shack-hartmann wave front sensor 또는 다른 원리의 wave front 센서가 있고 인텐서티 회절패턴 이미지에서 wave front 를 계산으로 추정해서 보정할 수도 있음. 이런 방식으로 수차 영향은 제거할 수 있음

이 이외에 초고해상도 방법이 있는데, 이는 다음번에 설명하기로 함

아베 (Abbe)의 현미경 해상도 분석

Ernst Abbe 아베는 현미경의 원리와 대물렌즈 설계 원리를 정립하였고, 현미경에서의 이미지 형성 그리고 이미지의 해상도에 대한 이론도 정립하였음. 여기서는 아베 이론을 설명함

아베는 회절격자를 샘플로 사용하여 해상도 제한의 원리를 분석하였음. 회절격자는 다중 슬릿으로 볼 수도 있고 유리기판에 촘촘한 사인파 표면을 만들어도 됨 [1+cos(2pi* v_x*x)]. 여기서 공간주파수 v_x 가 샘플의 해상도를 나타냄. 사인파 표면의 경우 푸리어 광학으로 설명할 수 있는데 평면파가 사인파 표면의 회절격자를 통과하면 사인파의 wave front를 가지게 됨. 이 사인파 wave front 는 일정 방향 (+1, -1)을 가지는 평면파와 0 방향의 평면파의 조합으로 만들 수 있으며 이들 평면파로 분리되어 진행함. 1+1/2*[exp (2pi*v_x*x) + exp(-2pi*v_x*x)]

그래서 회절격자를 통과해서 발생하는 평면파는 각도 (2pi*v_x)를 가지고 진행하는데 이 각도가 회절격자 사인파 무늬 공간 주파수와 비례함. 사인파 무늬 공간주파수가 높으면 (즉 사인파가 촘촘하면) 이 시료에서 출발하는 평면파들은 넓게 퍼지며 (각도가 커지며), 대물렌즈의 산술구경으로 수집하지 못할 수도 있음

만일 이 각도가 대물렌즈 산술구경 (NA = sin(theta)) 각도보다 작으면 +1 -1 방향의 평면파도 수집해서 이미지를 형성할 수 있으며 시료의 사인 패턴 이미지를 만들어 낼 수 있음. 회절격자에 의해 만들어지는 +1/-1 평면파의 각도는 sin (theta) 가 k_x/k 에 해당함. 즉 k_x/ k = 2pi*v_x/(2pi/lamda) = v_x*lamda 에 해당. 즉 NA = v_x*lamda. 하지만 각도가 너무 커서 대물렌즈가 회절된 평면파를 수집하지 못하면 이미지에서 사인파 형태를 구현할 수 없음. 즉 기준은 v_x = NA/lamda 임

Abbe 의 diffraction limit 은 v_x = 2*NA/lamda 임. 2가 어디서 나왔는지는 잘 모르겠음. 그러면 주기 p 로 나타내면 p = 1/v_x = lamda/(2*NA) 가 되고 0.5 lamda/NA 로 예전 에어리 디스크에서 계산한 공식과 같음

그래서 이 한계는 단일슬릿의 공식과 유사한 공식을 획득할 수 있음. 산술구경과 파장이 결정되면 대물렌즈가 만들어 낼 수 있는 최대 사인파 공간 주파수가 결정되며 이게 해상도가 되는 것임

위상 대비 현미경 (phase contrast microscopy)

세포는 투명해서 일반 현미경 이미지에서는 세포가 잘 나타나지 않음. 즉 세포 이미지의 대비도가 낮음. 이는 세포를 통과하는 빛의 위상 지연이 충분치 않아서 amplitude 및 intensity 변화를 만들지 못하였기 때문임. 위상 대비 현미경은 세포를 통과하는 빛의 위상 지연을 좀 더 키워서 세포 이미지 대비도를 향상시키는 방법임. 세포를 통과하는 빛과 세포 이외 주변을 통과하는 빛의 위상 차이를 좀 더 크게 함

세포를 통과하는 웨이브를 D wave (diffracted wave)라고 하고 주변 배경을 통과하는 웨이브를 S wave (surround wave)라 하자. 세포의 boundary를 지나가는 웨이브는 이들 두 웨이브의 합으로 S + D 가 될 것임. 이들 두개의 웨이브는 복소평면에서 회전하는 벡터로 표현할 수 있고 D wave 가 S wave에 비해 pi/2 위상차이가 난다면 S+D (S 벡터와 D 벡터의 합)는 두 벡터가 서로 수직이어서 resultant 벡터가 크기 (amplitude)가 별로 변하지 않음

위상 대비 현미경은 S wave 와 D wave 사이 위상 차이를 더 크게 만들어 두 벡터가 out phase로 결합하게 해서 크기 변화를 만드는 방법임. 이를 위해 조명광을 먼저 바꿈. ring beam 으로 조명 해서 시료에 의해 변하지 않는 surrounding wave (S wave) 방향을 트래킹 할 수 있게 함. 반면에 시료를 지나는 D wave 는 위상 변화도 있지만 사방으로 퍼질 것임. S wave 가 지나가는 path 에 phase plate 의 얇은 면이 대응되게 해서 S wave는 위상지연을 작게 하고 사방으로 퍼지는 D wave 들은 두꺼운 쪽을 지나가게 해서 위상 지연을 더 만듦. 그러면 D wave의 원래 위상지연 (pi/4)에 추가적인 위상지연 (pi/4)를 더하여 총 pi 의 위상지연을 만들 수 있으며 D wave와 S wave 는 out phase로 결합함. 그러면 D wave 와 S wave는 out phase여서 amplitude 차이를 만들어 낼 수 있음

위상 대비 현미경은 Frits Zernike 가 발명하여 1953년에 노벨상을 수상하였음

위상 대비 현미경은 순수하게 광학적으로 투명 샘플의 영상 대비도를 향상시킨 기술임

이와 유사한 기술로 DIC 현미경이 있음. DIC는 differential intensity contrast 의 약자로 위상 대비 현미경과 마찬가지로 투명한 시료의 대비도를 향상시키는 현미경 기술인데 편광을 활용하는 기법으로 나중에 편광을 설명한 후에 설명하겠음

편광 (polarized light)

편광은 transverse wave인 전자기파의 특성임. 전자기파는 전기장과 자기장의 상호 생성으로 만들어 지는 파동으로 전기장과 자기장은 진동은 파동의 진행방향에 수직 방향이어서 transverse wave라 불림 (반대말은 longitudinal wave). 편광은 전기장의 진동 방향을 나타냄. Transverse wave인 전자기파는 즉 파동의 진행방향이 일정하더라도 편광은 달라질 수 있음

예를 들면 z 축 방향으로 파동이 진행할 때도 전기장은 x 방향 또는 y 방향으로 진동할 수 있음. x 축 방향 성분을 E_x, y축 방향 성분을 E_y 라 하면 x 방향으로 진동할 때는 E_x 성분만 있는 경우 임

가장 일반적인 경우는 전기장이 x 방향 성분과 y 방향 성분 둘 다 있을 때임. E_x, E_y. 여기에 E_x와 E_y 의 상대적 위상을 phi 라 하면 이 세가지 변수로 다양한 편광을 나타낼 수 있음

E_x 만 있을 때와 E_y 만 있을 때는 선형 편광 ( [E_x, 0] 또는 [0, E_y]) 을 가지며, E_x 와 E_y 가 같이 있으면서 위상차가 없어도 대각선 방향의 선형 편광을 가짐 (E_x, E_y])

위상차가 있는 경우 편광 방향이 움직임 (E_x, E_y*exp(j*phi)]. 예를 들면 E_x 와 E_y 가 크기가 같고 위상차가 -90도 인경우 전기장 벡터가 ([E_x, -j* E_y]) 가 됨. 벡터 내 각 성분은 사인웨이브의 amplitude 이므로 amplitude 가 하나는 E_x 이고 나머지는 -j*E_y 라 함은 두 사인웨이브의 위상이 다르다는 의미임. 즉 x 축 방향의 사인웨이브에 비해 y 축 방향의 웨이브는 위상 지연이 있다는 의미임. 즉 E_x*cos(w*t) 이면 E_y*cos(w*t - pi/2) 가 됨. 시간에 따른 변화를 보면 전기장 방향이 [E_x *cos (0), E_y*cos(0 -pi/2)], [E_x*cos(pi/2), E_y*cos(0)], [E_x*cos(2*pi/2), , 이 회전하여 circular polarization 이라 함 .

+90도 인 경우에는 반대방향으로 회전함 ([E_x, -j* E_y]).

위상차가 일정한 값이고 E_x와 E_y 크기가 서로 다르면 elliptical polarization 이라 하며 가장 일반적인 경우 임 (E_x, E_y*exp(j*phi). 그러므로 편광 상태를 결정 지으려면 E_x, E_y 의 상대적 크기와 두개의 상대적 위상 phi 를 알아여 함

편광은 vector 로 나타낼 수 있음 [E_x, E_y*exp (phi)]'

편광 특성을 가진 빛의 생성

일반적인 빛은 편광 특성이 없는 비편광 광 (unpolarized light) 임

예를 들면 태양광은 차지를 띄고 있는 전자 원자 등이 랜덤하게 진동하므로 이들이 발생시킨 전자기파의 조합인 태양광은 편광이 없음. 반면에 레이저는 일반적으로 편광 특성을 갖고 있음

비편광 광을 편광으로 만드는 방법은 편광에 따른 선택적 흡수 (편광판 투과)와 반사 등이 있음

편광판은 특정 편광 방향만 투과 시키고 반대 편광 방향은 흡수하는 특성이 있음. 예를 들면 편광판을 회전시켜 수직 방향 만 통과 시키도록 얼라인 한다면 수평 방향 전기장은 흡수할 것임. 그러면 태양광이 이 편광판을 통과하고 나면 수직 방향 편광 특성을 가짐. 만일 다음 편광판을 수평방향 전기장을 통과 시키게 얼라인 하면 태양광을 완전히 막을 수도 있음. 조금씩 회전해서 얼라인 방향을 조절하면 이 두개의 편광판을 통과하는 빛의 세기를 조절할 수 있음. 위의 수직 통과 수평 통과 하도록 편광판 두개를 얼라인 한 경우를 cross polarization이라고 함

반사 또는 산란에 의한 polarization. 굴절율이 다른 물질을 빛이 지나가면 일부는 반사하고 일부는 투과하는 것을 프레넬 방정식으로 배웠음. 반사와 투과 비율은 입사각에 따라 달라지고 또한 편광에 따라 달라짐. 이는 편광 상황에 따라 경계조건이 달라지기 때문임. 그러므로 입사광이 비편광 특성을 가져도 반사하고 투과한 빛은 편광 특성을 가지게 됨. 이를 여러 상황에서 볼 수 있음

먼저 현상을 설명하겠음. 유리에서 반사되는 빛은 편광 특성이 있어 편광판을 잘 조절하면 반사빛을 완전히 제거할 수 있음. 또한 도로나 바다에서 반사되는 빛도 편광 특성이 있어 마찬가지로 조절하면 됨

레이저 끝단의 윈도우는 특정 각도를 갖고 있어 반사에 의한 손실이 전혀 없이 전부 투과시킬 수도 있음. 이는 레이저 공진기 안의 빛이 이미 편광이어서 각도를 잘 맞추면 반사를 0으로 만들 수 있는 각도가 있기 때문임

먼저 표면에서 반사되는 빛의 편광 특성에 대해 설명하겠음. 반사광은 s polarization 을 많이 갖고 있고 p polarization을 덜 갖고 있어 s polarization 특성을 나타냄. s polarization은 plane of xxx 에 수직으로 진동하는 전자기파 이며 p polarization은 평면 안에서 진동함. p polarization 은 더 많이 투과하므로 반사하는 빛은 p polarization 이 작고 s polarization 이 더 많음. s polarization은 표면을 기준으로 본다면 표면과 평행하게 진동하는 (수평으로 진동하는) 전기장임. 그래서 편광을 갖고 있는 선글라스는 수평 방향 편광은 차단하고 수직 방향 편광 만을 투과하도록 디자인 되어 있음

유리창에서의 반사의 경우 역시 유리창에 평행인 빛이 많이 반사 되므로 편광판의 방향을 조절해서 평행인 빛을 차단할 수 있으며 내부를 좀 더 잘 볼 수 있음

바이오 이미징에서도 cross polarization 을 많이 사용함. 레이저 조명을 하므로 한쪽 방향 편광을 갖고 있으며 direct 반사의 경우 편광을 유지하는 경우가 많아 direct 반사를 차단하려면 cross polarization 을 설치하면 됨

레이저 끝단 윈도우. 윈도우는 레이저 입사각이 Brewster angle 이 되도록 설치하여 p polarization 레이저 광이 100% 투과하게 함. air-glass interface 에서 약 57도 임. 이는 프레넬 공식으로 설명할 수 있으며 p polarization 이 100% 투과하는 각도임. 프레넬 공식에서 p polarization에서의 반사 계수는 입사각이 0도인 경우 -0.2이고 입사각이 증가할 수돌 계수가 0을 통과해서 1.0으로 감. 그러므로 입사각이 작은 경우 p polarization 빛은 반사계수가 -0.2 (0도) - 0 (57도) 사이여서 웬만하면 반사계수가 작고 대신 대부분 투과하는 것이 됨

Brewster angle 에서는 AR coating 없이도 반사를 0으도 만들 수 있는 어떻게 보면 매직 임

편광 특성을 바꾸는 또다른 방법은 birefringence 이며 이는 크리스탈이나 배열이 잘 되어 있는 바이오 물질에서 발생함

Birefringence (복굴절)

복굴절은 물질의 굴절율이 편광에 따라 다른 것을 의미함. 물질이 한쪽 방향으로 잘 정렬된 크리스탈 구조를 갖고 있어서 정렬된 방향으로 지나가는 전기장과 정렬에 수직인 방향으로 지나가는 전기장이 경험하는 상호작용이 다르며 그래서 굴절율도 달라짐 (n1, n2 를 갖고 있음, n_fast, n_slow)

만일 복굴절 물질에 대각선 방향으로 선형 편광되어 있는 빛이 입사한다면 입사광은 E_x, E_y 와 상대적인 위상인 phi 가 0임. 전자기파가 투과하면서 x 축 방향 진동 전기장과 y 축 방향 진동 전기장이 다른 지연을 받게 되고 상대적인 위상인 phi 값이 0이 아니게 됨. 그러면 편광이 변한 것이며, 입사 전기장과 다르게 투과한 전기장은 전기장 축이 계속 회전하게 되며 만일 cross polarization 편광판이 있으면 이 편광판을 통과하게 됨

복굴절 특성을 갖는 것은 크리스털 광물들 그리고 콜라겐 파이버가 잘 배열된 근육, 신경 다발 그리고 좀 덜 정렬되었지만 그래도 정렬성이 있는 피부 등이 있음. 원자구조가 정렬되어 있으면 정렬된 방향으로 진행하는 전기장과 반대 방향으로 진행하는 전기장 사이에서는 상호작용에 차이가 있어 지연되는 양이 달라짐

이들 복굴절 물질의 특성을 관찰 할 수 있는 현미경이 편광 현미경 임. 여기에는 편광판 두개가 cross polarization 으로 배치되어 샘플이 아무 일도 하지 않으면 투과 빛이 없는 상태임. 그런데 샘플이 복굴절 특성이 있으면 편광이 변해 (elliptical polarization) cross polarizer 를 통과하는 빛이 발생하여 우리는 샘플의 편광변화 특성을 알 수 있음. 이 방법은 조명광과 샘플의 상대 각도도 중요함. 조명광이 샘플을 대각선 선형 편광으로 들어가는 게 좋음. 즉 샘플의 n_fast, n_slow 축을 기준으로 45도가 되도록

아니면 조명광의 편광이 circular polarization 이 되면 좋음 (right 그리고 left circular 로 cross polarization을 만들어 차단할 수도 있음)

복굴절 특성으로 만든 편광 디바이스에는 half wave plate, quarter wave plate 등이 있음

Half & quarter wave plate

이들은 크리스털의 복굴절 특성을 활용해서 편광을 변화시키는 디바이스임. half wave plate 의 경우 n_fast 와 n_slow가 있는 복굴절 판이며 두께를 조절해서 두 편광 사이 lamda/2 지연이 있도록 만듦. quarter wave plate 의 경우 두 편광 사이 lamda/4 지연을 유발함. Half wave plate 의 경우 수평 선형 편광을 수직 선형 편광으로 만들 수 있으며 대각선 선형 편광을 반대 대각선 선형 편광으로 만들 수 있음

예를 들어 선형 +45도 편광 빛의 입력의 경우 E_x 와 E_y 가 같으며 위상차가 없음 (E_x = E_y = E_0). 이 사이에 lamda/2 위상 지연이 있으면 E_x에 비해 E_y가 - E_0가 되어 투과한 빛은 E_x = E_0, E_y = -E_0 가 되어 -45도 선형 편광이 됨

또한 quarter wave plate 의 경우 두 편광 사이 lamda/4 의 위상 지연을 만들어 선형 편광 상태를 circular polarization으로 변경할 수 있으며 circular polarization을 linear polarization으로 만들 수 있음. 선형 편광 상태의 입력에서 n_fast 와 n_slow가 45도로 회전해 있으면 이들 방향성분으로 decompose 하고 각 성분 사이에 lamda/4 딜레이가 있으면 사이 pi/2 위상차를 만들게 됨. 그러므로 투과한 빛은 circular polarization 이 됨

Liquid crystal (액정)

액정은 크리스털 구조가 twist 되어 있어 수직 편광이 들어가면 수평 편광으로 변경시켜서 나옴. 그래서 액정판에 cross polarization 편광판을 두면 대부분의 빛이 통과함. 여기서 액정판에 전기장을 걸면 전압에 따라 untwist 시킬 수 있어 액정판의 투과도를 조절할 수 있음. 그러므로 액정 디스플레이는 픽셀레이션 된 전극을 깔고 각 픽셀별로 전압을 조절하여 만듦. 이는 흑백 디스플레이이며, 2x2 픽셀에 RGB 필터를 추가하여 각 컬러의 세기를 조절하면 컬러 디스플레이가 됨

Second polarizer 각도 조절을 통한 빛 세기 조절

두번째 폴라라이저 각도 조절을 통해 빛 세기를 조절할 수 있습니다. 이 경우 첫번째 폴라라이저 를 통과한 전기장 방향에서 두번째 폴라라이저가 통과시키는 방향이 각도 theta가 있으면 전기장이 그 방향과 수직방향으로 decompose 되어 그 방향의 전기장만 통과 합니다. 그래서 세기의 경우 cos(theta)의 제곱이 됨

Differential interference contrast (DIC) microscopy

DIC 현미경은 phase contrast microscopy 와 유사한 목적을 가지는 현미경 기술로 세포 등 투명한 시료에 대한 고대비도 영상을 획득하는 방법 임. DIC 현미경의 원리는 좀 다른데 두개의 조명광을 만들고 조명광이 겪는 위상지연을 편광 변화로 영상화 하는 방법임

구체적으로, 조명광 빛을 편광에 따라 두개로 분리 시켜서 만듦. 두개의 편광 조명광이 샘플을 투과하면서 겪는 위상지연을 두개의 편광 조명광을 다시 결합했을 때 나타나는 편광 변화로 측정하여 이미지를 만듦. 먼저 편광판을 사용하여 대각선 선형 편광 빛을 만들고 Wollaston 프리즘으로 편광에 따라 빛을 분리시킴. 편광에 따라 분리된 두개의 조명광은 약간 shift 되어 있으며 나란하게 진행하면서 샘플 두께 변화에 따른 위상지연을 겪게 됨. 샘플을 지난 두개의 편광 조명광은 Wollaston 프리즘으로 다시 결합하고 cross polarization 으로 배치된 두번째 편광판을 통과함. 샘플에 의한 상대적인 위상지연이 없으면 두번째 편광판에서 완전히 차단되지만 위상지연이 있으면 편광 변화로 차단되지 않고 투과광이 수집됨. 그러므로 샘플에 의한 분리된 두개의 빛이 겪는 위상지연 차이를 측정하게 됨

Wollaston prism 은 편광에 따라 두개의 이미지를 만드는 프리즘임. 복굴절 특성을 가지는 편광 재료를 잘라서 크로스로 붙여서 만듦. 투과되는 빛이 편광에 따라서 굴절각이 달라져서 나뉘어짐

DIC 현미경은 분리된 두 편광 빛이 진행하는 방향 (shear axis) 에서의 광경로 차이를 측정함. 그래서 사물의 optical path delay 프로파일이 있으면 이를 미분한 형태여서 differential 이라고 명명함. gradient 를 측정하는 것으로 볼 수도 있음

DIC 이미지는 shear axis 방향에 따라 이미지가 바뀔 수 있음

형광 현미경

형광 현상을 활용하여 세포의 특정 단백질 그리고 소기관 만을 영상화 하는 현미경 기법. 샘플에 형광을 발현하는 분자체로 표지 (레이블) 한 뒤 여기광을 조명하고 형광광을 수집해서 영상화 함. 형광 분자체는 여기광의 에너지를 흡수한 뒤 흡수한 에너지를 형광광 형태로 방출하는데 형광광은 여기광에 비해 파장이 달라 (길어) 형광광을 쉽게 분리할 수 있음. 기존 투과 현미경과 달리 배경 신호가 없어서 아주 미세한 형광광도 감지할 수 있으며 고민감도 영상화가 가능함

다양한 파장의 형광을 발현하는 형광분자체로 레이블링 하고 분광 이미징 해서 컬러플한 영상을 얻을 수 있음. 더 많은 형광 파장을 구별할 수 있으면 더 많은 단백질을 동시에 구별할 수 있음. 예제로 보여주는 세포 그림에서는 세포핵, 필라멘트, 액틴, 그리고 골지 컴플렉스를 다른 형광분자체로 레이블링 해서 컬러 영상을 획득할 수 있음

형광분자체 레이블링 방법은 형광 분자체 자체가 특정 분자체에 결합할 수도 있고 안티바디를 형광분자체에 연결해서 안티바디가 결합하게 해서 형광을 발현하게 할 수도 있음. 아니면 유전자 조작을 통해 형광 단백질을 발현하게 해서 세포가 형광을 발현하게 만들 수도 있음

고대비도 고특이도 정량적 살아있는 세포 영상화가 가능함

형광 분자체 예. fluorescein & rhodamin

이들은 각각 초록색과 주황색 파장의 형광을 발현하는 대표적인 분자체임. 초록색 파장의 형광 발현을 위해 여기광은 이보다 파장이 짧은 파란색을 사용하며, 주황색 파장의 형광 발현을 위해서도 파장이 더 짧은 파란색 또는 초록색 여기광을 사용함. 형광 분자체는 형광 분자체는 여기 및 형광 스펙트럼 정보가 주어져서 어느 파장에서 여기되며 어느 파장에서 형광을 발현하는 지 알 수 있음

형광 기전을 설명하는 에너지 다이아그램 (Jablonski energy diagram)

형광은 분자체가 여기되었다가 기저 상태로 돌아가는 과정에서 에너지를 광자로 방출하는 것임

분자체의 에너지 상태에는 전자 에너지 상태와 진동 에너지 상태가 있으며 전자 에너지 상태에는 싱글렛 그리고 트리플렛 상태가 있음. 싱글렛 상태는 전자가 스핀 페어가 되어 스핀 모멘텀이 상쇄된 상태이며 트리플렛 상태는 스핀 모멘텀이 상쇄되지 않는 상태임. 기저 및 여기 전자 상태는 모두 싱글렛 상태로 S0, S1, S2 등으로 표현함. 기저 상태에 있던 전자가 에너지를 받으면 여기 상태로 진행하는데 여기 상태에서는 진동을 통해 여기상태의 가장 낮은 에너지 레벨로 이동함. 가장 낮은 에너지 레벨은 상대적으로 안정적 이어서 잠깐 머무를 수 있음. 이 시간을 형광 수명이라 하고 대체적으로 약 나노초 단위 임. 여기 상태에 있던 전자가 기저 상태로 되돌아 가면서 에너지를 방출하는데 형광의 경우에는 광자로 에너지를 방출하고 나머지 물질들은 열 에너지 등으로 에너지를 방출하고 기저상태로 돌아감

싱글렛 여기 상태에 있던 전자가 intersystem crossing 으로 트리플렛 상태로 드물게 진행할 수 있는데 이 경우 트리플렛 상태가 안정적 이어서 좀더 긴 시간동안 머물게 되며 광자를 배출하면서 기저 상태로 돌아가면 phosphorescence 라고 함. 이 경우 라이프타임이 훨씬 길어 밀리초 정도 됨. 반면 형광의 경우 라이프타임이 약 나노초 정도 됨.

형광 현상은 에너지가 높은 여기광 조명을 받아 형광 분자체가 여기광자를 흡수해서 외곽 전자가 여기 되었다가 기저 준위로 돌아갈 때 형광 광자를 배출하는 현상으로, 여기 후 형광광으로 에너지를 방출하기 전에 에너지 손실이 있으므로 형광광의 파장은 상대적으로 길게 됨

빛과 물질의 상호작용: 빛의 흡수

물질이 갖고 있는 에너지 준위가 광자의 에너지와 레벨이 유사할 때 흡수가 발생함

분자체의 에너지 준위로는 회전 에너지, 진동 에너지, 전자 에너지 상태 등이 있으며 이에 대항되는 주파수의 전자기파를 흡수할 수 있음

가장 낮은 분자체의 회전 에너지는 마이크로 웨이브와 에너지 레벨이 유사하여 흡수되며, 다음 단계인 분자체의 진동 에너지는 적외선 웨이브와 레벨이 유사해서 흡수됨

전자 에너지 레벨 사이에는 갭이 있는데 이게 가시광 주파수에 해당되며 그래서 분자체는 가시광과는 상호작용하지 않아 투명할 수 있음. 반면에 자외선 주파수 대역으로 가면 흡수가 다시 발생함

이보다 더 높은 에너지 레벨인 엑스선에서는 상호작용을 하지 않다가 이온화 하는 레벨에서는 다시 흡수함

분자체의 에너지 레벨로 본 물질과 빛의 상호작용

여기 및 형광의 경우 여기광의 광자가 분자체의 전자를 여기 시킬 수 있는 충분한 에너지를 갖고 있음

반면에 산란의 경우에는 에너지 흡수과정이 없으며, 그래서 같은 광자에너지의 광자를 방출함? 광자의 방향이 바뀌어서 산란이라 하며. 이를 레일리 산란이라 함

라만 산란의 경우에는 산란 과정에서 진동에너지 레벨에 도달 할 수 있으며, 이에 따라 산란광의 에너지가 작아지거나 (파장이 길어지거나) 에너지가 커짐 (파장이 짧아짐). 라만 산란은 확률이 매우 낮은 프로세스임

이 이외에 비선형 형광 또는 비선형 이차고조파 발생이 있는데 비선형 형광의 경우 두개의 광자가 동시에 흡수되어 광자의 에너지가 더해져 여기 상태로 진행하는 과정으로 흡수 확률의 제곱에 비례하는 비선형 현상이 됨. 형광광은 단광자 여기에 따른 형광과 같은 프로세스를 거침. 이차고조파의 경우도 마찬가지로 비선형 현상으로 발생하여 흡수 확률의 제곱에 비례함. 이차고조파는 주파수가 2배가 되고 파장은 두배로 짧아짐

에너지 레벨로 본 형광 현상과 여기 및 형광 스펙트럼 비교

형광체의 여기 및 형광 스펙트럼으로 여기에 필요한 파장 그리고 형광광의 파장을 파악할 수 있음. 여기광의 파장 대역은 여기에 필요한 에너지 레벨을 보여주는데 S0에서 S1으로 여기에 필요한 에너지 대역과 S0에서 S2로의 여기에 필요한 에너지 대역도 포함됨

형광광의 대역은 S1 최저 에너지 레벨과 S0 에너지 레벨과의 차이 에너지로 결정되는데 S0 에너지 레벨도 여러 vibrational energy levels 이 있으므로 형광광의 파장도 대역으로 나타남

여기 스펙트럼 피크에서 형광 스펙트럼 피크의 차이를 Stokes shift 라 함. 이 shift 가 크면 여기광과 형광광을 쉽게 분리할 수 있게 됨. 대체적으로 shift 가 크기 않으며 그래서 좋은 성능의 이색성 거울과 필터가 필요함

형광 현미경의 구성

형광 현미경에는 추가적으로 여기광 광원과 여기광과 형광광 분리를 위한 필터 세트, 그리고 고민감도 광센서가 필요함. 여기광 광원은 trans illumination 투과 방향보단 epi illumination 방향이 선호됨. 여기광은 수은 램프일 수도 있고 LED 광원일 수도 있음. 여기광 광원에서 출발한 여기광 빛은 이색성 거울에서 반사되어 대물렌즈로 전달되고 대물렌즈를 통해 샘플을 조명함. 샘플에서 발생한 형광광은 대물렌즈로 수집하고 이색성 거울에서 투과시켜서 카메라로 전달됨. 이색성 거울에 더해서 넓은 대역의 빛을 발생시키는 여기광 광원의 경우 여기광 파장을 선택하기 위한 여기광 필터, 이색성 거울을 통과한 형광광에서 이들 만을 투과 시키고 여기광 파장은 차단하는 형광광 필터도 필요함

이색성 거울을 포함하여 여기광 필터, 형광광 필터는 하나의 필터 큐브에 설치됨. 필터 큐브는 이색성 거울을 45도 각도로 갖고 있으며 파장이 상대적으로 짧은 여기광은 반사시키고 파장이 긴 형광광은 투과 시킴. 이색성 거울에 의한 여기광 반사 전에 여기광 필터를 거치고 형광광 투과 후에는 형광광 필터를 거치게 구성됨. 이들의 투과 특성 면에서 기술하면, 여기광 필터는 여기광 파장만을 투과시키고 이색성 거울은 여기광 파장은 낮은 투과도 (높은 반사도) 그리고 형광광 파장은 높은 투과도를 갖도록 구성되며, 마지막으로 형광광 필터는 여기광 차단을 위해 여기광 파장 투과도가 0%가 되도록 구성됨

멀티 컬러 형광 영상

다양한 파장의 형광을 동시에 수집하려면 이에 대응되는 여기광도 여러 파장이 있어야 하고 이색성 거울 및 형광 필터도 준비되어야 함. 일반적으로 한 형광 분자체에 대해 한 셋트 필터를 가지는 필터 큐브가 사용되고 여러 형광 분자체 영상화를 위해서는 필터 큐브를 교환하면서 촬영해야 하지만, 많이 사용되는 형광 분자체 컴비네이션에 대해서는 하나의 필터 큐브로도 해결할 수 있음. 예를 들면 DAPI, FITC, Texas red 형광체를 동시에 영상화 할 수 있는 여기광 필터, 이색성 거울 그리고 형광광 필터 세트가 있으며 이들은 각각 성능을 발휘하기 위해 멀티 밴드 투과 및 반사 특성을 가짐

형광 분자체

형광 분자체는 특정 단백질을 표지할 수 있어서 민감도와 특이도가 높음. 형광제는 단백질 그리고 핵산 등에 결합하는 것들도 있고, 특정 세포 소기관에 결합하는 것들도 있음. 그밖에 세포 내 동적 과정 과 미세환경을 모니터링 하는 것들, 세포의 상태를 감지하는 형광체들도 있음

형광 단백질의 경우 유전자 조작을 통해 다양한 단백질과 함께 발현하거나 특정 세포가 발현하도록 만들 수 있음. 점 라인에 형광 단백질이 발현하도록 만든 동물들도 있어서 한번 동물모델이 셋업되면 offspring 에서도 계속 발현하게 할 수 있음

형광 이미징에서 분광 이미징 및 영상처리

형광 이미징은 분광 이미징을 하게 됨. 분광 이미징을 위한 장치는 이미징 스펙트로미터를 사용할 수도 있고 멀티 채널을 구성해 영상화 함. 일반적으로 형광분자체의 발현 대역이 넓게 분포되어 스펙트럼이 서로 겹치게 됨. 즉 한 채널에서 특정 형광분자체 이외 주변의 형광 분자체 신호도 수집하게 됨. 이를 해결하는 방법으로 스펙트럴 언믹싱 기법이 개발됨

형광 현미경의 신호 감소: 광표백 및 퀜칭

형광 분자체는 신호가 미약하고 그리고 신호가 점차 감소함. 이는 광표백 또는 퀜칭 영향인데, 광표백의 경우 여기상태가 반복되는 형광 분자체가 비가역적인 분해로 형광 능력을 잃어버니는 현상임. 광표백을 활용해서 분자체의 확산 현상을 연구하는 방법도 있음

퀜칭의 경우 형광과 비형광 기전의 다툼으로 형광이 일시적으로 꺼지는 현상임. 퀜칭을 유발하는 분자체를 제거하면 형광이 다시 켜 질수 있으며 이를 활용하여 turn on probe으로 개발하기도 함

형광 분자체는 발현할 수 있는 형광광의 레벨이 있어서 오랫동안 형광 이미징을 해야 하는 경우에는 여기광의 세기를 적절히 조절할 필요가 있음

형광체의 특성

형광체의 형광 성능을 나타내는 여러가지 파라미터가 있음

extinction coefficient: 형광체가 여기광을 흡수하는 능력 또는 확률

quantum yield: 여기된 형광체가 형광광을 방출하는 확률

좋은 형광체는 extinction coefficient 도 높고 quantum yield 도 높음

형광수명 (fluorescence lifetime): 형광 분자체가 여기 상태에 머무는 시간. 여기 상태에 머무는 동안 화학적 반응성이 높음. 분자체의 고유 특성이어서 형광 스펙트럼이 겹치더라도 형광수명으로 분리할 수 있음. 미세환경 변화에 따라 형광수명이 바뀌는 데 이를 활용해서 미세환경 탐지에 사용될 수 있음. 형광수명의 측정은 펄스광으로 여기한 뒤 형광광의 발현의 시간적 분포를 측정함. exponential decay 를 하게되며 이의 시간상수가 형광수명임

형광 현미경의 광 센서 (형광광 탐지)

형광광은 매우 미약한 빛 이어서 민감한 탐지가 필요함. 이를 위해 카메라 칩의 경우 quantum yield 가 높은 것이 사용됨

일반적인 광센서 칩인 실리콘 CCD 센서는 quantum yield 가 제작 방법에 따라 90%까지 높을 수 있음. 가시광 대역에서. 그리고 이 칩에서 수집한 신호는 AD converter로 디지털 화 하는데 CCD 칩에서는 한개의 AD converter tap 만 있어 전송속도가 제한됨. 그래서 광센서와 함께 readout 회로를만들어 AD converter tap 숫자를 늘려 속도를 향상시킨 방법이 CMOS 센서임. 하지만 CMOS 센서는 노이즈가 평탄하지 않은 단점과 fill factor 가 낮은 단점이 있음. 그래서 CCD 칩에 CMOS readout 회로를 본딩한 sCMOS 센서가 개발됨

컨포컬 현미경 (confocal microscopy)

3차원 해상도를 가지는 현미경 기술. 샘플을 레이저 초점으로 조명하고 초점에서 발생한 광신호를 핀홀을 통해 수집하여 아웃 포커스에서 발생하는 배경신호를 핀홀을 통해 제거할 수 있음. 레이저 초점을 스캐닝하고 신호를 순차적으로 수집하여 영상을 재 구성함

1950년대에 Marvin Minsky가 발명함. 컨포컬 현미경은 그때 당시 주목을 받지 못하였음. 강한 광원이 없었고, 신호 처리를 위한 컴퓨터도 없었기 때문. 이후 80년대 브라켄호프, 쉐퍼드, 윌슨에 의해 개량되어 87년에 제품으로 출시되었음

초기에는 샘플 이송을 통해 영상화 되었음. 핀홀은 초점에서 발생한 신호만을 수집하고 아웃 포커스 면에서 발생한 신호는 핀홀에 의해 제거됨. 3차원 해상도가 획득 되었으나 속도는 느려짐. 이후 샘플 스캐닝이 아니라 레이저 초점 스캐닝 방식으로 개선되었음

3차원 해상도는 조명광의 점퍼짐함수와 핀홀에의해 만들어지는 수집광의 점퍼짐 함수의 곱셈으로 만들어 짐. PSF = PSF_ill x PSF_em. 그래서 점퍼짐 함수가 좀더 작아지고 아웃 포커스에서 발생한 빛은 감쇄가 됨. 점퍼짐 함수가 센터 부분이 1이고 주변부로 가면서 1보다 작은 값이라고 되며 PSF_ill 과 PSF_em 이 같은 함수라고 가정하면 가장자리에서는 1보다 작은 값이 제곱이 되므로 값이 작아지게 됨

실제 컨포컬 현미경에서는 핀홀의 크기를 조절할 수 있음. 수집 핀홀의 크기 조절에 따라서 깊이 해상도와 수집 신호 세기 간 밸런스가 조절됨

스캐너를 통한 레이저 스캐닝 구현

스캐너는 갈바노미터 스캐너 등이 사용되는데 미러의 회전 또는 각도 변경을 통해 반사되는 레이저 빔을 스캔할 수 있음

대물렌즈 back focal plane 에서 스캐너로 레이저 빔의 방향을 회전시키면 각도 변경이 레이저 초점 위치 변화에 대응되어 스캔할 수 있음. 하지만 공간상 제약으로 인해 대물렌즈 back focal plane 에 스캐너를 위치시키기 어려움. 그래서 렌즈 페어로 릴레이를 시켜 conjugate plane을 만들고 거기에 스캐너를 설치하고 구동시킴. 이를 위해 들어가는 렌즈는 스캔 렌즈와 튜브 렌즈로 불리며 4 f 형태로 구성함. 스캐너는 대체적으로 크기가 작아 스캔렌즈와 튜브렌즈를 통해 레이저 빔 크기를 확대시켜야 대물렌즈의 NA 를 다 사용할 수 있음. 그래서 스캐너는 좀 더 큰 각도로 스캔해야 함

샘플 레이저 초점에서 발생한 형광광은 같은 대물렌즈로 수집되고 조명 레이저 빔의 광경로를 따라서 진행함. 스캐너에서 반사된 뒤에는 디 스캔되어 레이저 빔이 고정됨. 여기서 이색성거울을 설치하여 이를 통해 형광광 만을 반사시키고 렌즈로 초점을 맞춘 뒤 핀홀을 통과시키면 컨포컬이 완성됨. 광신호 수집을 위해 고민감도 센서인 PMT 등이 사용됨

광센서

PN junction diode. 충분한 세기의 빛이 다이오드 정션에 도달하면 전자와 홀의 페어가 만들어짐. Reverse bias 로 걸린 전기장에서 전자와 홀이 반대방향으로 당겨져 전류가 발생함. 그래서 빛에 의해 전류가 발생하는 photoconductive mode 로 빛 신호를 감지함. PN junction diode 에서는 누설전류가 있어서 노이즈 레벨이 높아 고감도 빛 감지는 어려움

PIN diode. 추가적인 intrinsic undoped 레이어가 있는 광다이오드. 이를 통해 누설전류가 낮아지고 노이즈도 감소함. 하지만 아직 낮은 레벨의 빛 신호 감지에는 어려움이 있음. 이를 극복하기 위해 증폭단이 포함된 다이오드가 avalanche diode 임

Avalanche diode는 고전압의 reverse bias 가 걸려있어 빛에 의해 발생한 전자가 가속하면서 다른 원자를 이온화 시켜 눈덩이처럼 전자를 증폭시킬 수 있음. 그래서 컨포컬 현미경의 광 센서로 avalanche photo diode 가 활용되고 또한 PMT 도 활용됨

PMT 는 photo emissive 센서로 진공관 센서임. 광자가 cathode에 도달아면 전자가 방출되고 전기장 하에서 가속하고 다음 단계의 dynode에 충돌하여 더 많은 전자를 방출. 이러한 증폭 과정을 반복하여 증폭 게인을 확보하여 하나의 광자가 탐지 가능한 충분한 전류를 발생시키게 됨

고속 공초점 현미경

공초점 현미경의 영상화 속도 향상을 위해 하나의 초점이 아니라 다중 초점으로 스캔하고 다중 포인트에서 발생한 형광광을 수집함. 영상화 속도는 초점 갯수에 비례하여 증가함

다중 초점 형성과 이들의 스캐닝을 위해 스피닝 디스크 컨포컬 현미경이 개발되었음. 이는 마이크로 렌즈 어레이가 회전하면서 스캐닝 하고 샘플에서 발생한 형광광을 같이 회전하는 핀홀 어레이를 통해 필터링 한 뒤 수집해서 영상을 획득함. 회전하면서 스캐닝 하도록 마이크로 렌즈는 스파이럴 패턴으로 배치됨. 이를 니코프 디스크 타입이라고 함. 고감도 카메라로 수집하여 이미지를 형성함

실제 그림을 보면 스피닝 디스크가 정지한 경우 점점이 신호가 획득되었고 스피닝을 통해 스캔하여 샘플을 이미징 할 수 있음. 이 경우 영상화 속도는 카메라 스피드에 제한이 되며 초당 100 프레임 영상화도 가능함. 하지만 다중채널 이미징을 위해서는 카메라의 추가 설치가 필요함

레이저

특정 파장의 빛을 방출하고 이를 증폭하는 장치

1916년 아인쉬타인의 예측. 유도를 통해 빛을 방출할 수 있음을 예측함

51년 마이크로 웨이브 주파수 대역에서 유도 방출이 데모 되었음. 60년 가시광 주파수 대역에서 레이저가 데모됨. 루비 레이저. 그 이후 He-Ne 레이저, 반도체 레이저 등이 개발되었음

레이저 에서는 진행 광자의 자극으로 여기상태의 원자나 분자가 광자를 방출하도록 유도할 수 있음. 방출된 광자는 도달한 광자와 같은 에너지와 위상을 가짐. 이를 위해서는 population inversion 이 필요함

Population inversion 을 형성 및 유지. 광학적 또는 전기적 방법으로 원자 또는 분자를 여기 시키는 것이 가능함. inversion 을 유지시키기 위해서는 수명시간이 길어야 함. metastable state를 가지는 특정 원자가 있음. 또한 방출에 의한 감쇠보다 여기가 더 빨라야 population inversion 이 유지됨

3단계 또는 4단계 레벨 시스템. 여기 후 인접한 metastable 레벨로 진행함. 3단계 레벨 시스템에서는 metastable state 와 ground state 사이 경쟁하는데, population inversion 이 어려울 수 있음. 그래서 4단계 시스템에서는 ground state 에 lower level을 추가하여 metastable level과 lower level사이의 경쟁으로 population inversion 을 쉽게 유도함

유도 방출된 광자의 증폭. 유도 방출된 광자를 공진기 안에 대부분 가두어 빛 에너지를 증대시킴. 이는 두개의 반사 미러로 대부분 발생한 광자를 공진기 안에서 머무르게 하기 때문임. 광자가 반복하여 gain medium 을 통과할 때 마다 미디어 안에서는 추가적으로 광자가 유도 방출되어 점차 에너지가 쌓임. 공진기에서 일정 비율의 광자를 방출하면서 손실이 발생하는데 공진기가 이 손실을 메꾸면서 에너지를 증가 시킴. 일정 수준의 에너지 레벨이 되면 레이저 방출에 의한 손실도 충분히 커지고 추가 유도방출이 어려워져 게인이 낮아짐. 손실과 게인이 밸런스를 갖는 상태에서 정상상태가 됨

공진기에서 만들어 지는 정상파와 증폭 과정. 공진기에서는 특정 파장 또는 주파수의 정상파가 만들어 짐. 여러번 라운드 트립을 하여도 이들 정상파는 유지됨. 정상파의 파장은 공진기 길이를 정수배로 나눈 것이고 이의 진동수는 기본 주파수의 정수배가 됨. 정수배가 되는 진동수 중 증폭기가 특정 주파수 대역을 증폭하여 궁극적으로 이 주파수 만 공진기 안에서 유지가 되면서 광자를 방출함

게인을 주파수로 나타낸 그래프에서 게인이 가우스 커브를 그린다고 가정함. 게인이 큰 경우 게인 커브가 손실 레벨을 넘어가는 주파수 대역에서 다 증폭이 됨. 하지만 레이저 공진기 안의 에너지 가 커 지면서 게인 레벨이 점차 낮아지게 되고 여기서 게인과 손실이 일치하는 특정 주파수에서만 레이저 빛이 방출됨

레이저는 단일 파장이고 위상이 일정하게 유지되므로 결맞음이 높음. 웨이브 프론트를 특정 지을 수 있고 초점을 형성할 수 있음

레이저 종류

개스 레이저. 헬륨 네온 레이저가 대표적인 개스 레이저이며, 소량의 네온과 대부분의 헬륨 개스로 게인 미디어가 구성됨. 헬륨 원자가 에너지를 흡수하여 여기된 뒤에 여기 에너지를 네온 원자에 전달하여 여기된 네온원자가 광자를 방출하는 방식

액체 다이 레이저와 크리스탈 글래스 레이저도 있는데, 글래스 레이저에는 루비 레이저, 타이타늄 사파이어 레이저, 어븀 또는 이터비움 레이저 등이 있음

다이오드 레이저도 개발되어 소형 레이저 응용 범위를 넓힘. 예를 들어 레이저 포인터 등

파장 튜닝이 가능한 레이저가 있음. 타이타늄 사파이어 레이저는 증폭 대역이 넓어 튜닝이 가능함

펄스 레이저. 에너지가 펄스에 집중되어 주변 열적 손상을 최소화 할 수 있음. 주변 열적 손상을 피하기 위한 레이저는 마이크로초 나노초 펄스 레이저 등이 있음. 이는 열에너지 전달에는 나노초 정도 시간이 소요되기 때문임. 이보다 펄스 폭이 짧은 피코초 펨토초 펄스 레이저에서는 에너지 집중으로 비선형 현상을 일으킬 수 있음

펄스 레이저를 만드는 방법으로 큐 스위칭 레이저와 모드락 레이저가 있음

큐 스위칭 레이저는 공진기 내 미러의 반사도를 전기적으로 조절하여 펄스를 만듦. 닫아서 반사도를 높이면 공진기 내 파워가 빌드업이 되고 순간적으로 열면 펄스 레이저가 발생함. 이 방법은 마이크로초 또는 나노초 레이저를 발생시킬 때 사용함

모드락 레이저의 경우 공진기 안에서 정상파 사이 위상을 일정하게 유지해서 펄스 트레인을 만듦. 파장이 다른 정상파 들은 서로 간섭하고 일정 간격 마다 보강간섭이 발생해서 높은 크기의 펄스를 만들 수 있음. 펄스 폭은 간섭에 참여하는 정상파 파장 대역에 반비례 함. 모드락 레이저는 피코초 또는 펨토초 펄스를 만들 수 있음. 정상파 간 고정된 위상 관계를 유지하는 방법으로 능동적, 수동적 모드 락킹 방법들이 있음

레이저는 wide field imaging에서는 사용되지 않음. 간섭현상으로 스페클 패턴을 만들 수 있음. 이를 없애기 위해 여러 스크램블 방법이 있음

초고해상도 현미경

형광현미경의 해상도는 점퍼짐 함수로 결정되며 이는 파장의 절반 정도 임. 그러므로 500nm 파장 기준으로 하면 약 250nm 임

초고해상도 현미경은 해상도 한계를 극복하기 위한 방안으로 stimulated emission depletion microscopy (STED microscopy), structural illumination microscopy (SIM), 그리고 photo-activation localization microscopy (PALM) 이 있음

STED microscopy

여기광 초점에서 발생하는 spontaneous emission 기반 형광을 stimulated emission 을 통해 depletion 시켜서 spontaneous emission 이 발생하는 초점을 더욱 작게 만드는 방법. 이를 위해서 여기광 레이저 뿐만 아니라 STED를 위한 적절한 긴 파장의 레이저를 추가적으로 사용함

여기광 레이저 초점 주변에 stimulated emission을 위한 도넛 형태의 포커스를 추가적으로 만들고 이들을 중첩시킴. 도넛 형태의 레이저 초점은 phase plate 를 사용해서 만들 수 있는데 초점 가운데서 destructive interference 가 발생하여 크기가 0이 되도록 함. 그러면 초점 주변부에서는 대신 constructive interference 이 발생하여 도넛 형태의 STED 초점이 만들어짐. 이에 의해 만들어진 spontaneous emission 을 발생시키는 초점은 훨씬 작아지게 되어 해상도가 향상됨. stimulated emission으로 발생하는 빛과 spontaneous emission 으로 발생하는 빛은 이색성 거울에서 걸러지고 또한 형광필터로 차단하여 spontaneous emission 을 통한 빛 만을 수집함. 레이저 스캐닝을 통해 3차원 영상화 함

STED 현미경의 해상도는 STED 레이저 도넛빔의 세기에 의해 결정됨. 도넛빔의 세기 분포가 I_saturation 를 넘어가는 위치에서는 stimulated emission depletion을 만들게 되고 그 세기 분포의 반경에 따라 해상도가 결정됨

Structured illumination microscopy (SIM)

SIM 현미경은 해상도를 2배 향상 시키는 현미경 기술임. 이를 위해 눈에 보이지 않을 정도로 미세한 사인파 패턴 조명을 사용함. 패턴 조명은 회절격자로 빛을 분산 시킨 다음 +1/-1 오더와 0 오더 평면파를 조합하여 만듦. 이 패턴 조명을 미세하게 쉬프트를 시키면서 영상화 하고 이들을 조합하면, 쉬프트 시키는 방향에서 기존 해상도에서는 관찰하지 못한 미세한 구조도 영상화 할 수 있음

이를 수학적으로 표현하면 다음과 같음. 형광 현미경에서 조명을 받은 곳에서 여기되어 형광 광을 발현하므로 조명 패턴이 소스 영상에 곱해지는 관계이며 (공간 도메인), 이를 공간주파수 도메인에서 보면 이는 조명 함수와 소스 함수 간 convolution 이 됨. 조명 함수는 공간주파수 도메인 에서 DC 와 특정 주파수 +/- 에 임펄스로 위치하여 3게의 임펄스 함수로 표현되며 소스 함수는 공간주파수 도메인에서 원래 투과 주파수 대역을 표시하는 디스크를 포함한 사각형 이라 볼 수 있음. 그래서 이들의 convolution 은 사각형이 공간주파수 상에서 조명 주파수로 shift 되고 중첩되는 형태가 됨. 여기서 조명 사인파의 위상을 바꾸면서 (0도, 120도, 240도) 세개의 이미지를 획득하면 이들 3개의 식에서 각 shift 된 사각형 소스 함수 영상을 분리할 수 있음. 분리된 소스 함수 사각형에서 신호를 연산하고 이미징 함수의 곱을 통해 받으면 쉬프트 된 소스 함수에서는 원래 관찰되지 않던 고주파수 영역의 신호가 측정되며 이들을 활용해서 해상도가 2배 향상된 영상을 만들 수 있음

Photo-activation localization microscopy (PALM)

광활성화 형광체를 활용하는 영상법으로 localization 을 통해 초고해상도 영상을 획득할 수 있음

광활성화 형광체는 빛을 사용해서 소결과 활성을 조절할 수 있음. 예를 들면 488 파장의 빛으로 완전 소결과 일부 활성화가 가능하고 활성화 된 형광체는 633 파장에서 형광광을 낼 수 있음. 현미경 영상화 과정은 먼저 모든 형광체를 소결시킨 뒤 형광체들 중 일부 만을 활성화 시켜 형광 영상을 획득함. 일부만 활성화 시킨 상태에서는 이들 형광체들이 충분히 떨어져 있어 이들로 부터 형성된 점퍼짐 함수가 겹치지 않으며. 각 점퍼짐 함수 신호에서 센터 위치를 측정하여 표시하면 고정밀도 위치 특정이 가능하고 고해상도 영상화를 얻을 수 있음. 활성화된 형광체가 형광 발현을 통한 photobleaching 이 된 다음, 형광체들의 다음 일부를 활성화 시켜 형광 영상을 획득하고 센터 위치를 측정하고 표시하는 것을 반복함

형광체 센터 위치의 정확도 (또는 부정확도, uncertainty)는 형광광의 세기에 의해 결정되며 이것이 해상도를 결정함. 충분한 신호 세기를 수집하는 경우 수십 나노미터 해상도가 가능함

Quantitative phase microscopy (QPM, 정량적 위상 현미경)

투명한 세포에서 발생하는 위상 지연을 정량화 하는 현미경 기술. 정량화를 위해서는 시료를 통과한 빛의 필드 측정이 필요함. 그래서 off-axis reference arm 을 두거나 on-axis 에서 위상 변경을 하면서 측정함

off-axis reference arm 을 둔 경우 발생하는 패턴은 다음과 같음. 기준단 필드는 exp(j*(u0*x+v0*y)) 형태를 가지고 샘플단에서는 exp (j*del_phi(x, y)) 를 가짐

이들이 형성하는 이미지는 필드를 제곱해서 만들고 b(x, y) + c(x, y)*exp(j*(u0*x+v0*y)) + conj(c(x, y))*exp(-j*(u0*x+v0*y)) 형태를 가짐. 여기서 c(x, y) = E0*E1*exp(j*del_phi(x, y)) 임

2차원 푸리어 변환을 하면 B(u, v)+C(u-u0, v-v0)+conj(C)(u+u0, v+v0) 가 되고 여기서 C(u-u0, v-v0) 를 선택해서 inverse 2D FT 을 하면 c(x, y) 를 즉 del_phi(x, y)를 구할 수 있음

On-axis reference arm modulation 의 경우에는 링 패턴 조명에 의한 경사 조명과 그 링 패턴에 해당되는 부분을 spatial light modulator 로 딜레이를 주면서 3장 또는 4장의 영상 획득하고, 획득한 영상들을 조합해서 위상 영상화를 완성함

Ray transfer matrix (레이 전달 매트릭스)

레이를 y축 위치와 각도 alpha 의 벡터로 표시 [y, alpha]' 하고 레이 전달 방법을 매트릭스로 나타냄 y2 = A* y1+B*alpha1, alpha2 = C*y1+D*alpha1. 매트릭스는 [A, B; C, D] 임

축에서 크게 벗어나지 않는 레이에서 가능

자유공간 전파 매트릭스 [1, d; 0, 1]

렌즈를 나타내는 매트릭스: alpha1이 0인 경우와 y1이 0인 경우를 나누어 분석하고 합침

간단한 이미징 시스템에서의 레이 전달함수 활용. 초점면이란 alpha1 에 관계 없이 y1이 정해지는 경우를 의미함. 그래서 매트릭스의 [A, B; C, D] 에서 B=0이 되는 점 임

여기서 1/f = 1/s0 + 1/s1 이미징 공식이 도출됨

레이 전달 매트릭스는 thin lens 뿐만 아니라 thick lens 에서도 활용가능함. 여기서는 곡면에서의 굴절 매트릭스를 구해야 함. 굴절 매트릭스를 구하는 방법은 input 으로 y1 와 alpha1 가 들어가고 output 으로 y2 = y1 과 alpha2 를 구해야 함. alpha2는 굴절 법칙에서 나오는 n1*theta1 = n2*theta2의 theta1과 theta2를 활용해야 하는데 alpha1의 경우 theta1 -phi, alpha2 의 경우 theta' - phi 로 나타남. 여기서 phi 는 y/R 에 해당. 이를 정리하면 굴절 매트릭스를 구할 수 있음

Thick lens matrix 의 경우 첫번째 인터페이스에서의 굴절 (Mr1), 렌즈 물질 속에서의 진행 (Mt), 그리고 두번째 인터페이스에서의 굴절을 나타내는 매트릭스 (Mr2)의 곱으로 결정됨. M = Mr2*Mt*Mr1. 여기서 t를 0으로 만들면 thin lens matrix 로 만들 수 있음

레이 전달 매트릭스에서 각 항이 0이 되는 경우의 의미를 살펴볼 수 있음. 예를 들어 [A, B; C, D] 에서 B=0 이 되는 경우는 y2가 A* y1 이고, 입력 각도 alpha1에 관계없는 경우여서 이미징의 경우라 볼 수 있음

Deep tissue imaging: 공초점 현미경의 촬영깊이 한계

조직 내 영상화를 위해서는 현미경 기술이 3차원 해상도를 가져야 하며, 이에 대한 대표적인 기술은 공초점 현미경임. 공초점 현미경에서는 여기광이 조직 내 초점을 만들어야 하고 초점에서 출발한 형광광이 초점을 형성해 공초점 핀홀을 통과해야 함. 그런데 조직에서는 여기광의 산란으로 초점 형성이 어렵고 또한 형광광도 대물렌즈에 의해 수집되기 전에 산란하므로 공초점 핀홀 통과가 어려움. 그러므로 산란광은 영상에 기여가 어렵고 직진광 (ballistic photon) 만이 기여하게 됨

빛과 물질과의 상호작용 분석: 빛의 산란

그중 빛의 산란은 조직 심부 영상화를 제한하는 인자 중 하나임. 생체조직에서의 빛의 산란은 구름에 의한 빛의 산란과 유사한 형태임. 투명한 액체의 경우 빛이 대체로 직진하는데 우유와 같은 이멀전을 섞으면 빛이 산란하여 방향성을 잃게 됨

조직에서의 빛의 산란을 설명하기 위해서는 공기 분자에서의 빛의 산란을 설명해야 함. 빛은 공기 분자에서 산란함. 빛은 전자기파로 분자에 dielectric moment 를 유발하고 이들의 진동에 의해 유도 전자기파가 발생함. 이 유도 전자기파는 약간의 딜레이가 있음. 공기 분자는 서로 멀리 떨어져 있고 랜덤 분포를 가지므로 공기분자에 의한 유도 전자기파 사이 위상 관계가 있지 않아 발생한 전자기파를 90도 위치에서도 볼 수 있음. 반면에 유리나 물을 통과하는 전자기파에서는 분자가 서로 조밀하게 위치하므로 유도된 전자기파 사이에 위상 관계가 있으며 대체적으로 전진하며 90도 위치에서는 이들을 볼 수 없음

공기 분자에 의한 산란은 레일리 산란이라고 하며 산란은 파장의 4제곱에 반비례 함. 이는 주파수가 높을 수록 전자기파에 의한 산란의 확률이 높으며 한번 산란으로 발생하는 산란광에 의한 에너지 감쇠가 크기 때문임. 그러므로 산란은 파장에 매우 민감함. 파장이 짧은 빛은 먼저 산란해서 감쇄하고 파장이 길어지면서 산란 현상은 급결하게 줄어 듦

그러므로 하늘이 파란 것은 가시광 중에서 상대적으로 짧은 파장의 파란색 빛이 먼저 산란되어 우리 눈에 들어오기 때문이며, 선셋이나 선라이즈에서 태양이 붉은 것은 태양 빛이 공기층을 지나가면서 짧은 파란색 파장은 미리 산란되고 파장이 긴 붉은 빛 만이 남기 때문임

생체 조직에서는 레일리 산란 보다는 미 산란이 일반적임. 미 산란은 산란입자가 파장보다 큰 경우이며 입자 안에서 산란하며 상호 작용으로 주로 전진 산란을 만들어 냄. 반면에 레일리 산란은 전방과 후방에 골고루 산란에너지가 분포함. 또한 미 산란은 레일리 산란에 비해 파장 변화에 덜 민감한 특징도 있음

그러므로 생체 조직에서의 산란은 여전히 파장에 반비례 하며 전반적으로 전진 산란 특성을 가짐

빛과 물질의 상호작용: 빛의 흡수

생체조직에서의 흡수는 주로 생체조직에서 색깔을 띄는 chromophore 에 의해 결정됨. 기본적으로 물과 단백질은 가시광에서 흡수가 전혀 없으며, 자외선으로 가거나 적외선으로 가게되면 강한 흡수를 나타냄. 반면에 색깔을 띄는 피 (헤모글로빈 디옥시 헤모글로빈) 그리고 멜라닌 등이 가시광에서 강한 흡수를 나타냄. 멜라닌은 전반적인 가시광에서 강한 흡수를 나타내는데 그래도 파장에 따라 흡수도가 감소함. 옥시 헤모글로빈은 선홍색을 띄는데 이는 빨간색 (650나노미터)에서 흡수가 최소가 되고 파란색 초록색에서 흡수도가 높다는 것을 의미함. 디옥시 헤모글로빈은 상대적으로 빨간색에서도 흡수를 해서 칙칙한 빨간색을 나타냄. 그래서 옥시 그리고 디옥시 헤모글로빈은 서로 구별이 됨

그러므로 가시광과 근 적외선을 주로 사용하는 현미경에서는 흡수 보다는 산란이 주요 상호작용 인자이며 산란의 경우 파장이 길어지면 산란 영향이 줄어듦

생체 현미경에서의 촬영깊이

공초점 현미경에서도 여기광 산란이 파장이 더 짧으므로 형광광 산란 보다 더 강하게 영향을 미치며 이게 촬영깊이를 결정함

이광자 현미경과 딥티슈 이미징

이광자 현미경은 비선형 이광자 여기에 기반하는 형광 현미경임. 이광자 여기에서는 에너지가 낮은 여기광 광자 두개를 동시 흡수하여 발생하는 여기이며 여기된 형광체는 단광자 형광과 같은 형광 프로세스를 거치게 됨. 에너지가 낮은 여기광 광자 두개를 동시에 흡수하는 것은 상당히 낮은 확률을 가지는 프로세스 임. 예를 들어 여기광 광자 흡수 확률을 p 라고 하면 이는 여기광 밀도 또는 플럭스에 비례하는 값이 됨. p ~ flux. 여기광 광자 두개가 동시에 흡수되어야 하므로 이의 확률은 p^2 이 되어 확률이 매우 작아지고 또한 flux의 제곱에 비례함. 그래서 여기광 밀도가 높은 초점에서만 발생하고 초점에서 벗어나면 여기가 되지않음. 또한 확률이 매우 낮아 영상화가 가능한 수준으로 끌어 올리기 위해 펨토초 레이저를 사용함. 펨토초 레이저는 펄스가 도달할 때 여기광자의 밀도가 급격히 높아지므로 여기가 가능해짐

이광자 현미경에서는 여기광의 파장이 길어서 산란에 덜 민감함. 예를 들어 단광자 여기에서 400 나노미터가 필요하다면 이광자 여기에서는 800 나노미터로 여기 가능함. 파장이 길어져서 산란의 영향이 작아지고 직진 여기광이 심부에 침투할 수 있음. 또한 여기 초점에서 발생한 형광광도 공초점 핀홀 없이 모든 형광광을 수집하므로 형광광 산란에 덜 민감함. 단지 감응면적이 넓은 단일픽셀 광센서를 사용하면 됨

이와같은 효과로 이광자 현미경은 촬영깊이가 향상되었으며 기존에 촬영하지 못하던 심부까지 촬영 가능하여 생명학 연구에 큰 기여를 하였음

이광자 현미경은 이광자 여기를 위해 펨토초 펄스 레이저가 필요함. 펨토초 펄스 동안 두개의 포톤이 동시 흡수될 수 있으면 이광자 여기가 발생함

촬영깊이 향상을 위해서는 일단 이광자 현미경에서도 여기광이 길어져야 함. 이를 위해서는 장파장 형광 프로브가 필요하며 1300 나노미터 여기에서는 촬영깊이가 약 1 밀리미터도 가능함

촬영깊이 추가 향상을 위해서 삼광자 현미경이 개발되었음. 삼광자 현미경은 세게의 여기광 포톤이 동시 흡수되어야 하므로 확률은 더 낮지만 대신 여기광 파장이 길어지므로 직진 여기광이 심부에 침투할 수 있어 촬영깊이가 향상됨. 삼광자 형광을 위해서는 여기광 밀도가 더 높아져야 하므로 펨토초 오실레이터가 아니라 펨토초 증폭기가 필요함

Optical coherence tomography (OCT)

빛의 반사 기반의 3차원 영상기술. low coherence interferometry 기술을 기반으로 다른 깊이에서 반사되는 빛을 구별할 수 있음

low coherence interferometry 는 파장이 broad band light source 를 사용하는 간섭 기반 영상법임. 이에 반대되는 영상법은 레이저 기반 간섭계가 있음. 레이저 기반 간섭계는 샘플에서 반사되는 빛과 기준단에서 반사되는 빛의 간섭으로 샘플 반사면의 위치 변화를 측정하는 방법임. 경로차가 파장의 정수배 일 때 마다 보강간섭이 발생하며, 경로차 변화에 따라 간섭 신호가 wrapping 되며 간섭신호가 줄어들지 않음

LCI 의 경우 간섭신호가 제한된 경로차에서만 발생함. 즉 밴드 파장을 가지는 빛으로 간섭을 측정 하므로 경로차에 따라 각 파장의 간섭이 위상이 달라지며 모든 파장을 결합하면 간섭 신호의 위상 변화로 총 간섭신호가 작아짐. 그러므로 간섭 신호 측정으로 반사면의 위치를 알 수 있으며 여러 반사면을 가지는 샘플에서도 영상화 할 수 있음

간섭신호의 폭 (coherence length)은 깊이 해상도를 결정함. 간섭신호의 폭은 밴드 파장의 밴드 폭에 의해 결정되며 밴드 폭이 커지면 간섭신호의 폭도 짧아짐

간섭신호 측정은 time domain 측정 그리고 spectral domain 측정이 가능함. time domain 측정의 경우 기준단을 스캔 하면서 간섭신호를 측정하는 방법이며, spectral domain 측정의 경우 기준단을 고정 시켜 놓고 파장 또는 스펙트럼에 의한 간섭신호의 변화를 측정하는 방법으로 간섭 스펙트럼의 주파수 변화로 간섭 위치를 파악할 수 있음. 예를 들면 간섭 스펙트럼이 천천히 변화한다면 고정단 기준으로 샘플단이 가까이 있다는 것이며 고주파로 변화한다면 고정단 기준으로 샘플단이 꽤 멀리 있음을 나타냄

이는 편광판이 특정 방향의 빛을 흡수해서 그 방향의 90 방향만 투과시키기 때문임. 편광판 두개를 사용하면 투과광의 세기를 조절할 수 있음. 먼저 첫번째 편광판을 수직으로 두번째 편광판을 수평으로 얼라인 시키면 빛을 완전히 차단할 수 있음. 이를 cross polarization 이라 함

소형 광 소자에서 나오는 빛을 집속해 광 섬유로 전달할 수 있고 특정 파장의 빛을 만들 수 있어 의료에 사용됨. 여기에는 단일 파장이 필요치 않다면 레이저 이외 다른 광원을 사용할 수도 있음. 최근 개발된 펨토초 펄스 레이저는 3차원 절개를 통한 미세 수술에도 활용되고 있음.

레이저는 결맞음 특성을 갖고 있음. 레이저에서 발생한 광자 웨이브들은 일정하게 유지되어서 나누어서 경로를 달리 했다가 다시 합쳐도 서로 간섭하는 것을 의미함. 반대로 결맞음 특성이 없는 빛은 발생하는 광자 웨이브들 사이에 위상 관계가 없거나 유지되지 않으므로 경로가 다른 빛을 결합했을 때 간섭이 발생하지 않음. 좀 더 자세한 사항은 나중에 다루기로 함

레이저는 cavity 안에서 증폭되며 스탠딩 웨이브로 돌아다니는 광자 웨이브가 방출되는 것이어서 이를 공진기라고 부르기도 함. 공진기는 진동자 처럼 기계 장치일 수도 있는데, 레이저는 광학적 공진기 임. 공진기에서 발생하는 신호의 주파수를 분석해 보면 공진기의 특성을 파악할 수 있음. 이상적인 공진기는 단일 주파수 만을 갖고 있음. 하지만 공진되는 스탠딩 웨이브가 불안정 하면 단일 주파수가 아니라 주파수가 일정 영역의 밴드를 가지게 됨

주파수 또는 파장이 약간 다른 웨이브가 같은 위상으로 출발하고 일정 거리를 전파하면 위상 관계가 180도 나는 거리가 있음. 이 거리를 coherence length 라 함. 이를 계산하는 방법으로는 입력으로 파장이 다른 두 웨이브 (lamda, lamda + delta_lamda) 가 있음. lamda 웨이브가 N 번 진행했을 때 거리를 coherence length 라 하면, lamda+delta_lamda 웨이브는 그 거리를 N-1/2 번 진행으로 도달함. 이의 방정식을 풀면 coherence length와 delta_lamda 의 관계를 알 수 있음. 즉 결맞음 거리와 주파수 밴드 사이의 관계. 주파수 밴드를 측정하면 결맞음이 유지되는 거리를 알수 있게 됨

Coherence length는 간섭계를 통해 측정할 수도 있음. 간섭계는 빛을 나누고 경로차이를 두고 다시 결합했을 때 발생하는 간섭을 측정하는 장치로, 빛 파장 단위의 서브 마이크론 아니 나노 단위의 미세한 경로차이 변화를 감지할 수 있음. 간섭 패턴이 이상적인 경우는 완벽한 보강간섭 및 상쇄간섭으로 0과 1을 왔다갔다 하겠지만 광원의 coherence length 한계로 간섭 진폭이 점점 줄어 듦.

결맞음 (coherence)이 있다는 의미는 빛을 두갈래로 분리한 뒤 경로차를 두고 다시 합쳐도 경로 차가 나는 두 빛들 사이에 위상 관계가 있고 간섭을 일으킬 수 있음. 결맞음이 높다는 것은 두 빛 사이 경로 차를 많이 만들어도 간섭이 발생한다는 의미임. 레이저는 발생의 원리가 stimulated emission 을 통한 증폭 (amplification) 이어서 스탠딩 웨이브로 캐버티 안에서 맴도는 빛의 일부가 방출되는 것이며 다른 시간에 방출된 빛에서도 위상 상관관계가 있음

결맞음

결맞음은 두가지가 있음. 공간적 결맞음과 시간적 결맞음

시간적 결맞음이 위의 경로차가 다른 두개의 나뉘어진 빛이 서로 간섭하는 것을 의미하는 것이며 이것이 발생하기 위해서는 단일파장이어야 하며 위상 관계를 가져야 함. 레이저를사용한 간섭계에서 발생하는 간섭이 시간적 결맞음임

코히런트 및 인코히런트 이미징

코히런트 이미징은 이미징 시스템이 빛 웨이브의 위상 정보를 유지하는 경우. 간섭 패턴에 옵젝트의 정보가 들어 있음. 홀로그래피 등

인코히런트 이미징은 이미장 시스템이 이미지 형성에 기여하는 빛 웨이브의 위상 정보를 유지하지 못함. 옵젝트 정보가 간섭 패턴에 들어 있지 않음

코히런트 이미징은 위상 정보로 옵젝트 정보를 제공, 하지만 위상 정보 유지를 위해 시스템이 복잡해 짐

부분적 코히런트 이미징은 양쪽의 장점을 가지려는 방법. 빛 웨이브가 어느 정도의 코히런스를 갖고 있어서 위상 정보를 제공하지만 완전하지는 않음. 정보 제공도 있지만 너무 복잡하지는 않음.

통계 광학. 랜덤 라이트 필드 (random light field). 통계 함수 (statistical functions), 상호 코히런트 함수 (mutual coherence function). 분광 밀도 (spectral density), 상호 관계 함수 (correlation function).

현미경의 역사

현미경은 긴 역사를 가지고 있음. 빛의 굴절과 굴절을 활용한 안경 (spectacles)는 1400년도 부터 있었고 배율을 향상시킨 현미경은 1600년대 발명되었음. 초점거리가 짧은 대물렌즈를 가공하는 기술로 높은 배율을 구현하였으나 색깔의 번짐 등 광 수차 (optical aberration) 문제로 확대를 하더라도 사물을 선명하게 관찰할 수는 없었음. 그렇지만 코르크 나무 단면 관찰로 감옥 셀 (cell) 구조가 있음을 밝혔고, 벼룩 등 초소형 생물들의 존재도 밝혔음. 이를 통해 미생물학 세포생물학 등이 시작되었음

1700년대에 광수차 문제 중 색번짐인 chromatic aberration을 해결하는 achromatic doublet 렌즈가 발명되었고 곧 대물렌즈에도 적용되었음. 광학 현미경은 1800년대 부터 대량생산 되어 생물학 연구실에서 사용되었음

1950년 이후 광학현미경은 급격한 발전을 이루게 되었는데 이는 광원인 레이저의 발명 때문임. 기존 광학현미경의 광원은 백열등 등으로 빛 조절에 어려움이 있었는데 레이저를 사용하면서 3차원 해상도를 가지는 공초점 현미경 등을 제작할 수 있게 되었음. 레이저 뿐만 아니라 컴퓨터와 반도체 기술을 기반으로 하는 광센서, 광 조절장치, 카메라 기술등의 발전으로 더욱더 고성능의 현미경 기술들이 개발되고 있음

레이저에서도 기존의 continuous wave (CW) 레이저 이외에 펄스 레이저들이 개발되었는데 micro-, nano-, pico-, femto-second pulse lasers들은 고에너지 집속을 가능하게 하여 의료용 레이저, 비선형 화학 물리반응 연구, 그리고 비선형 현미경에 활용되고 있음