蛋白質電泳分析

　　　　　　　　　指導教授：鄭惠春老師

壹、實驗課程簡介

今日的課程中，我們在早上學習如何製作SDS電泳的膠體以及學習SDS電泳的原理，並且於下午進行電泳操作。

貳、實驗樣本與器材

一、電泳設備

電泳槽、電極、電源供應器

二、電泳設置

酒精、拭鏡紙、洗瓶(內容物:ddH₂O)、擦手紙

三、製膠台設備

膠條、尺梳、厚玻板、短玻片、製膠支架、垂直電泳槽製膠台

四、膠體配製

（一）上膠（stacking gel）

H₂O、29% Acrylamide Mix、1.0M Tris、10% SDS、10% Ammonium Persulfate(APS)、TEMED、微量滴管(pipette)、pipette tip、保麗龍箱(冰桶用)、離心管

（二）下膠（runnung gel）

H₂O、29% Acrylamide Mix、1.5M Tris、10% SDS、1% TCE、10% Ammonium Persulfate(APS)、TEMED、微量滴管(pipette)、pipette tip、保麗龍箱(冰桶用)、離心管

五、樣本配置

染劑、marker、BSA (Bovine Serum Albumin) 牛血清白蛋白

參、實驗原理

一、藥品

1.Acrylamide Mix：成膠的基本單位(孔洞形成)

2.Tris：維持溶液的電中性及pH值

3.SDS：界面活性劑，使蛋白質均帶負電

4.Ammonium Persulfate(APS)：自由基的提供者

5.TEMED：幫助傳遞自由基的催化劑

二、SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳

(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis )

1.原理：

SDS-PAGE為變性的蛋白質電泳，可依分子量分離出不同大小的蛋白質。
透過SDS（界面活性劑）破壞蛋白質二級結構，且讓蛋白統一帶負電（因為SDS可以破壞蛋白質的氫鍵和疏水作用力，使蛋白質處於伸展狀態）
利用蛋白質與外加電場的交互作用，進行蛋白質的分離【1】。
電泳通電時，電流從上而下，造成上端為負電場，下端為正電場。經由SDS處理過後的蛋白質帶負電,因此蛋白質會從負極往正極跑。而電泳的速度則與蛋白質大小成反比，電泳速度越快，蛋白質愈小；電泳速度越慢，蛋白質愈大。

2.應用：

西方墨點法

肆、實驗步驟

一、製膠台設備設置

1.用酒精與擦拭紙將厚玻版與短玻片擦拭乾淨

2.將膠條、厚玻板與短玻片裝入製膠支架中

3.使用洗瓶將ddH₂O倒入以測試膠台的緊密度，並用擦手紙把水吸乾

二、膠體配置(因Acrylamide有神經毒性，需全程配戴手套操作)

1.配置 running gel：將 H₂O 4.5mL、29% Acrylamide Mix 2.7mL、1.5M Tris 2.5mL、10% SDS 100µL、1% TCE100µL依序加入離心管中

2.將離心管蓋起並搖晃使之均勻

3.將10% Ammonium Persulfate(APS) 100µL、TEMED 6µL依序加入離心管中

4.將下膠用pipette（0.9mL*8）放入厚玻片與短玻板中，並在上層加入酒精使之定型

5.在等待30分鐘使下膠反應完全時，配置stacking gel：將 H₂O ３.4mL、29% Acrylamide Mix 830µL、1.0M Tris 630 µL、10% SDS 50 µL、10% Ammonium Persulfate(APS) 50 µL、TEMED 5µL依序加入第二個離心管中

6.將裝有上膠的離心管放入冰桶中

7.30分鐘後，先將上層的酒精倒掉，再將配置好的stacking gel加入，並插入10wells尺梳(盡量不要有氣泡)

8.室溫靜置30~60分鐘直至凝固

三、跑膠

1.將早上製備的膠體拆下，邊沖水(將泡泡沖去)邊拆，並將尺梳拆下(在水檯邊操作)

2.用夾子將膠體夾於電泳槽內，並加入1X running buffer於槽中

3.將電泳槽與電源供應器連結(注意電線顏色)將電壓調至100V並作用30分鐘

4.當dye跑至下膠時，將電壓調至180V；當dye跑至buffer中，即停止通電

5.將buffer倒至水槽後，將夾子拆除，於水槽邊沖水並使用刮刀將膠體刮下，再放置於小盒子中置於UV box中拍照

伍、實驗結果

製膠器材

跑膠完照相的結果

實驗後的膠體

陸、實驗紀錄與檢討

在跑膠的過程中，我們這組的速度特別慢，其他組都已經跑到膠體的一半時，我們的還在三分之一處，所幸助教後來幫我們調高電壓，才讓跑膠過程加速不少；而從UV box 拍照的結果，我們也發現在loading的過程中有滲漏出來，也由於跑膠過程後半段的電壓調升，導致我們最終的圖形不是很完美。即使如此，我們仍然覺得此次的實驗非常有趣，操作了一個以前沒有做過的電泳實驗!

柒、參考資料來源

【1】http://juang.bst.ntu.edu.tw/Protein/Analysis/A3.htm

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