光合作用光反應之探索

一、器材

分光光譜儀、量筒、研缽、燒杯、茶葉袋、手電筒、微量吸管(pipette)、pipette tip、比色管(Cuvette)

二、材料

菠菜、0.5M 蔗糖溶液、0.05%DCIP、1mM DCMU、紅墨水

一、光譜儀基礎操作

（一）用紅墨水測各波長燈卡吸光值(A)

1.插電並打開光譜儀電源

2.用pipette吸取1mL的水與1mL的紅墨水分別裝入不同的Cuvette中

3.選取波長405nm的燈卡放入光譜儀

4.將裝有水2mL的Cuvette放入光譜儀中，並將L值轉到100進行校正

5.校正完後將裝有水的Cuvette取出，放入含有紅墨水的Cutette進行測量並記錄

6.改用波長470nm、515nm、590nm、615nm、648nm的燈卡，重複進行步驟3.~5.

（二）繪製standard curve

1.選取（一）中吸光值最佳之燈卡

2.將裝有紅墨水之Cuvette用水稀釋到小於1，測量其吸光值並記錄，將其稀釋倍率訂為1

3.用紅墨水：水體積比1：1（1mL：1mL）配置新濃度的紅墨水並放入另一個Cuvette中

4.將新配置好的Cuvette放入光譜儀中，測量其吸光值並記錄，其稀釋倍率為1/2

5.重複步驟3~4三次，其稀釋倍率分別為1/4、1/8與1/16

6.將數據用excel做成散佈圖，並標示出R²值

二、葉綠體光反應實驗

（一）在黑暗的條件下葉綠體溶液加入DCIP後的吸光值

1.分離葉綠體（以下步驟皆須在冰上進行）

（1）取2克洗乾淨的菠菜葉片剝碎放入研缽中，將研缽置於冰上

（2）加入10mL 0.5M蔗糖液研磨，製作粗萃取液

（3）將粗萃取液倒在茶葉袋中進行過濾

（4）將濾液放在冰上保存，蓋上蓋子避免照光

2.取一Cuvette，加入葉綠體濾液後測量其在590nm的吸光值(A590)，用0.5M蔗糖溶液將其稀釋至0.4~0.6為最佳

3.在Cuvette中加入100µL DCIP並混合均勻

4.測量A590，此為zero time control

5.將Cuvette留在光譜儀中，每30秒記錄一次A590的值，共記錄2分鐘

（二）在照光的條件下葉綠體溶液加入DCIP後的吸光值

1.取實驗（一）中稀釋至吸光值0.4~0.6的葉綠體濾液

2.在Cuvette中加入100µL DCIP並混合均勻

3.將Cuvette放入光譜儀中，並用手電筒從上方貼附Cuvette照射，每30秒記錄一次A590的值，共記錄2分鐘

（三）在照光的條件下葉綠體溶液加入DCMU與DCIP後的吸光值

1.取實驗（一）中稀釋至吸光值0.4~0.6的葉綠體濾液

2.在Cuvette中加入10µL DCMU反應2分鐘

3.再加入100µL DCIP並混合均勻

4.將Cuvette放入光譜儀中，並用手電筒從上方貼附Cuvette照射，每30秒記錄一次A590的值，共記錄2分鐘

  在本次的實驗中，有關於用手電筒照光測量葉綠體溶液吸光值變化的部分，為了避免在記錄時的短暫時間因外部光源影響實驗結果，我們在每30秒紀錄的時候，會先關起光譜儀Cuvette上面的蓋子、手機計時按暫停，記錄完再同時按下計時器、打開蓋子使葉綠體溶液照射到手電筒的光，減小人為導致的誤差。另外，由於葉綠體光反應實驗（二）與（三）的步驟略有不同，起初我們一開始看不太懂實驗步驟，但在找助教與教授詢問後，我們釐清了實驗（三）必須先加入DCUM再加入DCIP，而且也不能用實驗（二）結束後的溶液進行實驗（三）。再確認實驗步驟後，我們最後成功完成實驗。