Le analisi microbiologiche

La contaminazione delle acque potabili è la principale causa di malattie infettive nel mondo. Questa può essere derivante da fonti puntuali, come impianti di trattamento o fabbriche, e da fonti non puntuali, come lo scarico di acqua inquinata da attività quotidiane. L’inquinamento può contaminare fiumi, laghi e corsi d'acqua, influenzando infine le risorse idriche utilizzate per l'approvvigionamento idrico. Ricercare i singoli microrganismi potenzialmente pericolosi è un'operazione difficile e dispendiosa e per questo motivo la famiglia dei coliformi è essenziale, in quanto possono essere utilizzati come indicatori di contaminazione fecale per la valutazione della qualità dell'acqua.

Infatti, un campione d'acqua negativo per i coliformi si presume essere privo di microrganismi dannosi, rendendo l'acqua sicura per il consumo umano. D’altra parte invece, se il campione risulta essere positivo ai coliformi saranno necessarie ulteriori prove per approfondire ed indagare la natura della contaminazione.

"I coliformi sono batteri aerobi ed anaerobi facoltativi, gram-negativi, non sporigeni, bastoncellari, che fermentano il lattosio con produzione di gas e di acido in 24-48 ore, a 36 ± 1 °C. I coliformi totali appartengono alla famiglia delle Enterobacteriacee ed includono generi quali Escherichia, Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter; la definizione di tale gruppo non si basa su criteri tassonomici, ma su specifiche reazioni biochimiche.

Escherichia coli è l’unico parametro microbiologico che figura tra i parametri di base da ricercare nella matrice acqua per la classificazione dei corsi d’acqua."

Ann Ist Super Sanità 2005;41(3):353-358 Indicatori microbiologici e valutazione della qualità delle acque superficiali Rossella BRIANCESCO Dipartimento di Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, Istituto Superiore di Sanità, Roma

La legge italiana in materia di norme ambientali, prescrive come metodi di determinazione di contaminazione fecale, la ricerca dei coliformi utilizzando il metodo MPN oppure la ricerca attraverso il metodo delle MF (membrane filtranti) attraverso la filtrazione di campioni di acque opportunamente campionate.

DECRETO LEGISLATIVO 3 aprile 2006, n. 152 Norme in materia ambientale. (GU n.88 del 14-4-2006 - Suppl. Ordinario n. 96)

Determinazione dei coliformi

Esistono diverse pratiche per quanto riguarda il controllo e l’enumerazione dei coliformi. La metodica che seguiremo è quella dell’MPN attraverso l’uso del Brodo Bile Verde Brillante.

IL BBVB è un terreno selettivo per la determinazione dei coliformi e dei coliformi fecali con metodo MPN. La presenza del verde brillante sopprime la crescita dei batteri anaerobi lattosio-fermentanti (Clostridium perfringens) non ottenendo in questo modo falsi positivi; il verde brillante ed i sali biliari inibiscono la crescita dei microrganismi Gram-positivi.

Consiste in una prima prova presuntiva in BL (Brodo lattosato). Si allestiscono 3 serie di brodi in provetta con campanella di Durham.

1^ 10 mL di BL a concentrazione doppia nei quali si seminano 10 di acqua dell’Arno.

2^ 10 mL di BL a concentrazione standard nei quali si seminano 1 mL di acqua dell’Arno.

2^ 10 mL di BL a concentrazione standard nei quali si seminano 0.1 mL di acqua dell’Arno.

Si osservano i risultati della crescita microbica dopo 24 ore di incubazione a 37 °C. Le provette positive al test presuntivo saranno quelle che presentano intorbidimento e gas in campanella.

Tabella di McCrady

Questo test è presuntivo perché molti sono i microrganismi che utilizzano il lattosio presente nel BL. Quindi per essere certi della presenza dei coliformi, si effettua una subcoltura delle provette positive al test del BL in un brodo che permetta la crescita dei soli batteri che sono capaci di vivere nell'ambiente intestinale degli animali a sangue caldo.

Come? Usando elementi selettivi come i sali biliari

Si seminano 1 mL di ogni coltura di BL positiva in una corrispondente di Brodo Verde Bile Brillante che è un brodo selettivo per la crescita dei coliformi. Anche in queste provette si inserisce una campanella di Durham per verificare la produzione di gas in seguito all’utilizzo del lattosio e successiva fermentazione del piruvato.

Si osservano i risultati di crescita dopo incubazione a 37 °C per 24 ore e si confrontano le provette eventualmente positive per determinare il numero più probabile di coliformi presenti in 100 mL di campione secondo le tavole di Mc Crady

I risultati ottenuti

Dal campionamento di febbraio sono risultate positive nel BL solo due provette nella prima serie e 2 nella seconda serie, mentre nessuna positività nel BVBB.

Dal campionamento di aprile sono risultate positive nel BL solo due provette nella prima serie e nessuna positività nel BVBB.

Quindi le osservazioni che possiamo fare sono le seguenti:

Entrambi i campioni prelevati in marzo e maggio NON contengono batteri coliformi
La crescita batterica è da attribuire a batteri ambientali. Quindi gli impianti di depurazione delle acque reflue attive lungo il corso dell’Arno funzionano molto bene (almeno sotto il profilo microbiologico).

Per ulteriore conferma abbiamo seminato per spatolamento 0.1 mL di campione in un terreno cromogeno, TBX, specifico per l’ E. coli che quando presente su questo terreno sviluppa delle colonie colorate dall’agente cromogeno in blu. Ricordiamo che l’ E. coli è il microrganismo indicatore di presenza di coliformi.

I risultati dimostrano che sia nell’incubazione a a 20 °C che a 37°C, temperatura ottimale per la crescita dei batteri della flora microbica intestinale, non sono cresciute colonie di E. coli ma di microrganismi ambientali.

A sx coltura a 20 °C a dx coltura a 37°C

TBX con crescita Escherichia coli β-glucoronidasi positivi

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