aCD3-stimulation

Giorno 0

Preparare le soluzioni di anti-CD3 ed anticorpo di controllo in PBS sterile per colture celllari

(di solito 2 microgrammi/ml dell'anticorpo 1452C11 della BD/Pharmingen, ma provare anche le concentrazioni 5 e 10 microgrammi/ml).

We have new commercial Ab at 0.5 mg/ml i.e. half µg/µl

4 (2µg) to 20 (10µg) per ml PBS.

One 24 well plate requires 24 times 400 µl i.e. 9.6 ml

Thus have 40 µl in 10 ml for one 24 well plate

Insolubilizzare l'anti-CD3 e l'anticorpo di controllo dispensando 25 microlitri/well di soluzione di anticorpo in una piastra da 96 pozzetti, oppure es. 3-400 microlitri/well in a 24-multiwell plate.

7,7 µl stock (1,3 µg/µl) in 10 ml makes one 24 mw dish.

15 µl stock (0,55 µl/µl) in 3,3-4 ml makes 10 wells of a 24 multiwell dish.

Lasciare O/N a 4°C, oppure 3h a 37°C.

Le piastre possono essere preparate in anticipo e lasciate a 4°C con la soluzione di Ab indefinitamente.

Giorno 1

Preparare una sospensione di splenociti in 5 ml di RPMI 5% FCS e controllare la vitalita' cellulare (deve essere superiore al'90%; usare solo cellule fresche; non usare cellule congelate in precedenza)

Rimuovere la soluzione di antiCD3 dalla piastra e lavare 3-4 volte i pozzetti con PBS 5% FCS.

Dispensare 2 milioni di splenociti/well (96mw) o 6 mln/well (24 mw) e mettere la piastra in incubatore

N.B.: Come controllo utilizzare LPS (1 microgrammo/ml), ConA (5 microgrammi/ml), CPG (10 microgrammi/ml)

Giorno 6 per avere un completo differenziamento a plasmacellule, raccogliere le cellule, lavarle in PBS 5% FCS un paio di volte prima di aggiungere anti-CD3-PE (o marcato con un altro fluorocromo) e procedere a sortare le le cellule CD3- al FACS.

Giorno 9-10 per avere anticorpi dosabili nei sovranatanti, accogliere i sovranatanti per dosare gli anticorpi.