イソギンチャクの研究法

イソギンチャクの研究を始めるにはどのようにしたらいいのだろうか？

そんな新米研究者のための研究法解説ページです。筆者も最近研究し始めた新米であるため、学んだことを順々に乗せていくので更新はゆっくりです。

参考文献

・新付着生物研究法-主要な付着生物の種類査定ー日本付着生物学会編　第４章イソギンチャク類

こちらは日本の千葉県立中央博物館でイソギンチャクの研究をされている、柳　研介　研究員が書かれたものになり、研究法が非常に詳しく載っています。

・なぜテンプライソギンチャクなのか？　

こちらは現在、広島県福山大学の講師をされている、Drクラゲさんこと泉　貴人講師が書かれたものになり、泉節という泉さんの独特な口調のまま研究者としての軌跡を面白く書いているものであり、イソギンチャクの種類や研究法も載っています。

３．組織切片標本作成

イソギンチャクの同定には内部構造である、隔膜の配列や構造、周口筋や足盤筋の様相などを観察しないといけない。そのため、ミクロトームを使用して組織切片を作成・染色して内部形態観察用プレパラートを作成します。非常に長い工程になるので、包埋・切り出し・染色の大きく3つに分けて解説します。

3－1　包埋

この工程では固定標本を切り出しやすいように、パラフィンに置換します。

必要なもの

・80％エタノール, 90％エタノール, 100%エタノール

・キシレン

・パラフィン

・パラフィン置換用カセット

3－2　切り出し

3－3　染色（マッソントリクローム染色）

4．DNA解析

DNA解析はイソギンチャクの種を研究する上で欠かせない解析になっています。

工程としては、DNA抽出、PCR及び精製、シーケンス解析、系統解析の4つになります。それぞれ非常に多くの方法がありますが今回は僕が何を使っているのかの紹介を行います。

4－1 DNA抽出

4－2 PCR及び電気泳動

4－3 系統解析

系統解析には様々なソフトウェアが必要になる、いつかそのダウンロード方法も解説すると思う。

系統解析ソフトのダウンロード方法解説

ここではダウンロード後の使用方法について解説する。

4－3－1,　アライメント

4－3－2,　モデル解析

使用ソフトウェア：Modeltest-NG 

起動コマンド：①cd　/modeltest/bin

　　　　　　　② ./modeltest-gui

4－3－3,　系統解析

使用ソフトウェア①：RAxML-NG　（ML法）

起動コマンド：raxml-ng

解析コマンド：raxml-ng --all --msa <alignment_file> --model <model> --bs-trees 1000 --threads 4 --prefix <output_file>

上記のコマンドで　ブートストラップ1000回の系統解析ができる。しかし、これはブートストラップ値が記載されている系統樹ができない。

そのため次のコマンドでコンセンサスツリーを作る

コンセンサスツリーを作成するコマンド：raxml-ng --support --tree <best_tree_file> --bs-trees <bootstrap_trees_file> --prefix <output_name>

これでできたファイルがML法によって作成された系統樹となる。大体name.support.という名前になって保存されているはず。

使用ソフトウェア②　MrBayse

起動法　ダウンロードした　MrBayse.exe をクリック

注意点　NEXUSファイルでないと使用できない。また、MEGAでアライメントしてNEXUS形式にすると、読み取り形式指定する部分で変更が必要

　　　FORMAT MISSING=? GAP=- MATCHCHAR=. datatype=nucleotide;　という部分を

　　　FORMAT MISSING=? GAP=- MATCHCHAR=. DATATYPE=DNA;　　　

というように一部を手動で変更してから使用する。

また、ファイルのリンクに日本語で\home\kenta\デスクトップ\alignment_file　というように入ってしまうとうまくいかないので、ネットワークから　C:\\　に保存して行うとうまくいく。

解析コマンド　Execute　<Alignment_file>　＃これでデータをインポートする

その後TAXA名が羅列されると成功。

次にモデルの設定　lset nst=2; # モデルを設定、モデル毎に数字が違うので調べる（nst=2はHKY）

もしG4などのパラメーターが必要な場合

　　　　　　　lset rates=invgamma; ＃G4モデルの設定その都度調べる

次に世代指定　mcmc nruns=2 ngen=5000000 samplefreq=100;

 # 2つの独立したMCMCラン、5000000世代、100世代ごとにサンプリング 

mcmcコマンドで解析が開始するので　Nrunsの指定と世代数、サンプリング数は1行で書く。

これで解析が開始する。

じゃあ、解析の間に語彙の勉強でもしましょう。教えて！ChatGPT先生！

・MCMCとは、確率分布からのサンプリングを行うための一連のアルゴリズムの総称で、特にベイズ推定や統計モデリングにおいて広く使用されます。MCMCの基本的なアイデアは、マルコフ連鎖を使用して、計算が難しい確率分布からのサンプルを生成することです。 (chat GPT4oより）

この時に適切なバーンイン数や世代数を指定しないと適切なデータが得られない。

・バーンインとは、マルコフ連鎖モンテカルロ（MCMC）法やその他のシミュレーション手法において、最初のいくつかのサンプルを捨てるプロセスを指します。バーンインの目的は、サンプリングが収束するまでの初期段階で得られるサンプルを排除し、より信頼性の高い結果を得ることです。 (chat GPT4oより）

・世代数とは、世代数はアルゴリズムが実行される回数や、モデルがサンプリングを行う回数を指します。具体的には、MCMCプロセスが行われるステップの数や、提案された状態が受け入れられるかどうかの評価が行われる回数です。 (chat GPT4oより）

・世代数指定の基準

モデルの複雑さ:

• 使用するモデルが複雑であるほど、収束するまでに必要な世代数が多くなることがあります。より多くのパラメータや状態を持つモデルでは、十分なサンプリングが必要です。

データのサイズ:

• データセットのサイズが大きい場合、パラメータの推定に必要な世代数も増加します。大きなデータセットは、より多くの情報を提供するため、より多くのサンプルが必要です。

収束の診断:

• MCMCアルゴリズムが収束するまでの世代数は、収束診断によって評価されます。複数の独立したMCMCランを行い、その結果を比較することで、収束しているかどうかを確認します。収束が確認できるまでの世代数が世代数の基準になります。

バーンインの期間:

• バーンインとして捨てるサンプル数が指定される場合、世代数はバーンインを考慮に入れて設定されます。例えば、5000000世代のMCMCを実行し、最初の25%をバーンインとして捨てる場合、実際に解析に使用されるサンプルは3750000世代分となります。 

ーーー以上ChatGPT4o先生の語彙授業でした。

次に　バーンイン指定（バーンインとは、初期の計算は安定しないので結果を破棄する期間のこと）

設定コマンド　sump burnin = 25;  ＃初期の25%の結果はバーンインする（通常10％～25％の間で行う）

最後に　sumt burnin = 25; サンプルの要約を行い系統樹を出力する。