Los mejillones (M. galloprovincialis) proceden de bateas localizadas en la Ría de Vigo (42°13'53.3"N 8°49' 03.5"W). Los mejillones están permanentemente sumergidos en este hábitat. Todos los animales son donados por acuicultores y transportados dentro de las 12 h posteriores a la recolección al laboratorio en hieleras forradas con toallas de papel empapadas en agua de mar.
Para el cálculo de muestra se utiliza el software EPIDAT® v4.2, desarrollado por el Servicio de Epidemiología de la Dirección Xeral de Saúde Pública da Consellería de Sanidade (Xunta de Galicia) con el apoyo de la Organización Panamericana de la Salud (OPS-OMS) y la Universidad CES de Colombia.
Se estima el cálculo poblacional total de la Ría de Vigo en 478 bateas, la producción media por batea es de 20 kg/m de cuerda, y tienen una media de 500 cuerdas. Cada mejillón en fresco pesa de media 30 gr. Con estos datos se obtiene una población de 4.000.000 individuos por batea, aunque se va utilizar como dato de población infinita (∞).
El cálculo de muestra mínimo realizado para una población infinita, con una proporción esperada del 50%, ya que se conoce poco de la población, con un nivel de confianza del 95% y un error del 5%, da un total de 385. En este estudio se seleccionará solamente una población de 30 individuos.
Congelación
Diez ejemplares. Se mide la talla (longitud y ancho de la concha) de cada individuo. Posteriormente, se registran y se limpian externamente las valvas, se secciona el músculo aductor posterior, se escurre el agua intervalvar y se registra el peso de cada individuo. Se congelan enteros con concha a -20ºC durante mínimo 6 días. Se seleccionan 5 ejemplares aleatoriamente para análisis.
Cocción
Diez ejemplares. Se mide la talla (longitud y ancho de la concha) de cada individuo. Posteriormente, se registran y se limpian externamente las valvas, se cuecen hasta que se abran (aproximadamente 3 minutos) y se registra el peso de cada individuo. Se mantienen refrigerados en nevera hasta su preparación.
Se extrae todo el tejido seccionado el músculo abductor posterior, se extrae las partes de tejido para el análisis y el resto se congela a -20ºC. Se seleccionan 5 ejemplares aleatoriamente para análisis.
Fresco
Diez ejemplares frescos. Se mide la talla (longitud y ancho de la concha) de cada individuo. Posteriormente, se registran y se limpian externamente las valvas, se secciona el músculo aductor posterior, se escurre el agua intervalvar y se registra el peso de cada individuo. Se seleccionan las partes de tejido para análisis y el resto se congela a -20ºC por si hiciese falta realizar análisis posteriores. Se seleccionan 5 ejemplares aleatoriamente para análisis.
Fresco
Tras la selección aleatoria se realiza una toma de muestra mediante Punción Aspiración Aguja Gruesa (PAAF) con aguja de 25G y jeringa de 10ml en la bolsa Polichinela y mediante técnica de impronta de la gónada (tejido del manto) de cada espécimen. Se realiza una extensión en portaobjetos de las muestras obtenidas mediante PAAF (tabla 1) y para la técnica de impronta (tabla 2), se hace contacto mediante varios toques de la muestra sobre el portaobjetos.
A continuación se tiñen con Diff-quick (tabla 3) para el estudio citológico. El resto de muestra se congela. Esta técnica de tinción se emplea tanto para la muestra obtenida por PAAF como por impronta.
Se realiza una toma de muestra de una pequeña sección (0,5 - 1 cm) de la parte central de la gónada (tejido del manto) y branquias, para llevar a cabo el procesamiento histológico explicado en la tabla 5. El resto de la muestra se congela.
Se realizan cortes en micrótomo de rotación, con unos 5-8 µm de espesor y a continuación se tiñen con Hematoxilina-eosina (proceso explicado en la tabla 6) para el estudio histológico.
Cocción
Una vez abiertos los espécimen tras la cocción, se seleccionan aleatoriamente 5 ejemplares para su análisis. Se extrae todo el tejido seccionado el músculo abductor posterior, y se registra el peso de cada individuo. Se extraen las partes de tejido para el análisis y el resto se congela a -20ºC. Se seleccionan 5 ejemplares aleatoriamente para análisis.
Para la obtención de la muestra, el corte y la tinción se realiza de la misma manera que con el tejido en fresco.
Congelación
Se seleccionan aleatoriamente 5 ejemplares para su análisis. Se descongelan y se registra el peso de cada individuo. Se extraen las partes de tejido para el análisis y el resto se congela a -20ºC.
Para los sujetos congelados se realizan los mismos procesos realizados previamente en los sujetos frescos y cocidos, para la obtención de muestra, corte y tinción.
Se registran, limpian, miden y pesan 30 ejemplares, de los cuales 10 son sometidos a congelación, 10 a cocción y 10 en fresco. Se seleccionan aleatoriamente 15 individuos, 5 en cada estado. Se procesan un total de 105 muestras, 30 Punción Aspiración con Aguja Fina de la bolsa de Polichinela, 15 improntas de la gónada (tejido del manto), 15 bloques/muestras histológicas del tejido manto, 15 bloques/muestras histológicas de branquia y sus respectivos portaobjetos para visualización.
Consello regulador da denominación de orixe Mexillón de Galicia. (s. f.). Mexillón de Galicia, Mexillondegalicia. Recuperado 26 de enero de 2022, de https://www.mexillondegalicia.org
Dobal Amador, V. (2008). Estudio molecular de los mecanismos implicados en la inducción de neoplasias gonadales en Mytilus galloprovincialis por efecto de la intoxicación por hidrocarburos. UVigo - Escola Internacional de Doutoramento. http://www.investigo.biblioteca.uvigo.es/xmlui/bitstream/handle/11093/1212/DovalAmador_Vladimir_TD_2019.pdf?sequence=1
Falfushynska, H. (2020, 15 febrero). Effects of intermittent hypoxia on cell survival and inflammatory responses in the intertidal marine bivalves Mytilus edulis and Crassostrea gigas | Journal of Experimental Biology | The Company of Biologists. Journal of Experimental Biology. Recuperado 26 de febrero de 2022, de https://journals.biologists.com/jeb/article/223/4/jeb217026/223851/Effects-of-intermittent-hypoxia-on-cell-survival
García-García, J. A. (2013, octubre). Cálculo del tamaño de la muestra en investigación en educación médica | Investigación en Educación Médica. Sciencedirect. Recuperado 15 de febrero de 2022, de http://www.riem.facmed.unam.mx/index.php/riem/article/view/419
Huerta, A. F. (2020, 3 marzo). La memoria del mejillón gallego. The Conversation. Recuperado 26 de enero de 2022, de https://theconversation.com/la-memoria-del-mejillon-gallego-132925
Megías, M. P. M. (s. f.). Técnicas Histológicas. Protocolos y recetas. Hematoxilina y eosina. Atlas de Histología Vegetal y Animal. Recuperado 27 de enero de 2022, de https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/protocolos/p-tincion-h-e.php
Reyna-Urrutia, V. A., González-González, A. M., & Rosales-Ibáñez, R. (2022). Compositions and Structural Geometries of Scaffolds Used in the Regeneration of Cleft Palates: A Review of the Literature. Polymers, 14(3), 547. https://doi.org/10.3390/polym14030547
Ruiz Y., Suárez P., Martinez A.A., Vidal A., Juan F.S. (2014) Histopathological Alterations of the Mantle of Mytilus galloprovincialis from the Ria of Vigo (NW Spain): Effect of Persistent Chemicals?. In: Sauvé G. (eds) Molluscan Shellfish Safety. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-94-007-6588-7_21
Santos, S., Tutora, V., Ma, Cabildo, D., Facultad, M., Ciencias, D., De, D., Orgánica, Q., & Bio-Orgánica, Y. (2017). TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA UNIVERSIDAD NACIONAL DE EDUCACIÓN A DISTANCIA MÁSTER UNIVERSITARIO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA QUÍMICA. Recuperado 26 de febrero de 2022, de http://e-spacio.uned.es/fez/eserv/bibliuned:master-Ciencias-CyTQ-Ssantos/Santos_Vidal_Sara_TFM.pdf