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LAB NOTE
How to make Axenic Medium (AM)
10xPE less Medium
PE stock
- Sonicate 100 ml of PE stock soln. for 10 min.
- Add 4000 ml of DDW to beaker.
- Add 500 ml of 10x PE less medium while stirring.
- pH medium to pH 7.0
- Bring the volume up to 5 L with DDW.
- Cool and tighten caps of bottles or tubes, then store at room temp for several weeks.
10xPE less Medium
- Proteose Pepton (Difco 0120-01) 452 g (1 bottle)
- Trypticase (Becton Dickinson 11921) 250 g
- Yeast RNA (ICN 102927) 50 g
- Add DDW, then Stir until all dissolved. 2.5 L
- MgSO4 25 g
- 500 ml of 100xVitamins stored at -20 ℃
- 5 ml of Stigmasterol (0.0025g/ml, dissolved in ab. alcohol, Sigma S6126). 50 ml store at 4 ℃
- Adjust pH with NaOH (pH 7.0).
- Bring the volume up to 5 L with DDW.
PE stock
- Phosphatidyl-ethanol amine (Type II)
- HOUNEN Soybean Lecithin (J-OIRUMIRUZU)
- d-Pantothenic acid calcium salt (ICN 101228)
- Niacinamide USP (Nicotinic acid amide,
- Pyridoxal-HCl (ICN 102767) 0.5 g/l
- Pyridoxamine-di HCl 0.25 g/l
- Riboflavin (ICN 102813) 0.5 g/l
- Folic acid (ICN 101725) 2.5 g/l
- Thiamine HCl (ICN 103028) 1.5 g/l
- D-Biotin sol (ICN 101025) 25.0 mg/l
- DL Thioctic acid (ICN 101138) 5.0 mg/l
ゾウリムシの培養法 Culture Method for Paramecium
培養の基本は，「研究者が教える動物飼育 第 1 巻 共立出版」に詳しく記載している．
- 稲わら法： 乾燥した稲わらを 4 cm くらいの長さに切り，1 l ビーカーに １ l の水につき 5 g の割り合いで稲わらをいれ，約 15 分間煮沸する．液が淡黄褐色になったところで火を止め，熱をさます．稲わらは，いれたままで，耳かき一杯の NaHCO3 を加えることにより，pH を調整する．この溶液を蓋をせずに一晩放置し，ゾウリムシを接種し，アルミホイルなどで蓋をする．通気できる程の緩い蓋が望ましい．1-2 ヶ月おきに，新しく培養し直せばよい．
- レタスジュース法： 新鮮な市販のレタスの主脈をとり，重さを計る．500 gで 1 l のジュースが得られる．レタスは，蒸留水で洗い，沸騰させた蒸留水に約 30 秒間浸して，酵素を失活させて，もう一度室温の蒸留水にうつし冷却する．次に，ミキサーあるいは，ジューサーにかける．このとき適当に蒸留水を加えても良い．得られたジュースを 8 枚重ねのガーゼでろ過し，得られたろ液を，蒸留水で希釈する（最初に 500 gのレタスがあったとすると，最終量が １l になるように水を加えれば良いだけである）．このジュースを適当な容器（試験管や，三角フラスコ等）に分注し，綿栓をする．綿栓をしたら，間欠滅菌（100℃ 15 分間を 3 日間）し，冷蔵庫で保存する（凍結させて保存しても良い）．上記のレタスジュースを蒸留水で 40 倍に希釈し，NaHCO3 を 1 l あたり 1 g の割り合いで加えて，オートクレーブにかけ滅菌する．十分に冷却し室温に戻ったら，これにバクテリア Klebsiella pneumoniae あるいは，Bacillus subtiles を植えて，その翌日ゾウリムシを接種する．
- 青汁法：市販の大麦若葉 ３ g （粉末）を 50 ml のコニカルチューブにいれ、40 ml のDDWを加え良く混ぜる。オートクレーブで、121℃ 20 分間滅菌した後、3,000 rpm で 10 分間遠心して、上澄みをとり、1 g Na2HPO4 を加えて、1 l に希釈して、再び 121℃ 20 分間滅菌したものを培養液として使用する。これにバクテリア Klebsiella pneumoniae あるいは，Bacillus subtiles を植えて，その翌日ゾウリムシを接種する．
- カロリーメイト法
- 無菌培養法
2x PB (pH 7.2) Na2HPO4 : 25.55 gKH2PO4 : 2.72 gNaN3: 0.8 g
これらを 2 L の DDW に溶かし，2 倍のストック液を作っておく．pH を NaOH で調整する（pH 7.2)． 使用時は，随時希釈する．
2x PBS (pH 7.2) Na2HPO4 : 25.55 gKH2PO4 : 2.72 gNaN3 : 0.8 gNaCl : 35.4g
これらを 2 L の DDW に溶かし，2 倍のストック液を作っておく．pH を NaOH で調整する（pH 7.2)． 使用時は，随時希釈する．
6% HCHO in PBHCHO : 8.1 ml 2x PB : 25 mlDDW : 16.9 ml
使用する直前に準備する．3ヶ月程は室温で保存可
蛍光退色防止剤1.4 Diazabicycleo-[2,2,2], octane : 1.25 gGlycerol : 35 mlPB : 15 ml
REFERENCES
Soldo Salt Solution (pH 7.0) Soln. ANaCl：0.06 gCaCl2・2H2O：0.6 gMgCl2・6H2O：0.19 gDDW：400 ml
Soln. BKH2PO4：0.06 gK2HPO4：0.0685 gDDW：400 ml pH を NaOH にて調整する．
Soln. A および B をそれぞれ別にオートクレイブし（予め混ぜて熱を掛けると，沈殿が生じる），冷めてから混合し，滅菌水で，1 L までメスアップする．4℃ で保存する．
REFERENCES
これらを 2 L の DDW に溶かし，2 倍のストック液を作っておく．pH を NaOH で調整する（pH 7.2)． 使用時は，随時希釈する．
2x PBS (pH 7.2) Na2HPO4 : 25.55 gKH2PO4 : 2.72 gNaN3 : 0.8 gNaCl : 35.4g
これらを 2 L の DDW に溶かし，2 倍のストック液を作っておく．pH を NaOH で調整する（pH 7.2)． 使用時は，随時希釈する．
6% HCHO in PBHCHO : 8.1 ml 2x PB : 25 mlDDW : 16.9 ml
使用する直前に準備する．3ヶ月程は室温で保存可
蛍光退色防止剤1.4 Diazabicycleo-[2,2,2], octane : 1.25 gGlycerol : 35 mlPB : 15 ml
REFERENCES
Soldo Salt Solution (pH 7.0) Soln. ANaCl：0.06 gCaCl2・2H2O：0.6 gMgCl2・6H2O：0.19 gDDW：400 ml
Soln. BKH2PO4：0.06 gK2HPO4：0.0685 gDDW：400 ml pH を NaOH にて調整する．
Soln. A および B をそれぞれ別にオートクレイブし（予め混ぜて熱を掛けると，沈殿が生じる），冷めてから混合し，滅菌水で，1 L までメスアップする．4℃ で保存する．
REFERENCES
間接蛍光抗体法 Indirect Immunofluorescence Method
- 固定： 固定は，3% のホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液（PB, pH 7.2）をもちいる．手順としては，細胞懸濁液（培養液）と6% ホルムアルデヒドを含む PB を 1: 1 で混合することで行う．固定時間は 45 分間室温（24℃）で行う．すべての過程は試験管中で行うが，細胞数が少ないときは，デプレッションスライドで行う．本研究室では，蛋白室定量用の直径 1 cm 長さ 10 cm ほどのプロテインチューブを使用している（約 4 ml）．
- リンス: 上記のリン酸緩衝液（PB, pH 7.2）にて 20 分間，室温で 3 度リンスする．リンスに際しては，PB を上記の試験管に ３ ml ほど一気に加え，15 分放置する．細胞はやがて下に沈むので，吸引ピペット（水道につけたアスピレーターを利用）で上澄を吸い取る．この作業を 3 回繰り返す．
- 膜の可溶化処理：吸引して上澄の PB を十分に取り除く． 冷凍庫で -20℃ に冷やしたアセトンを 2 ml 程加えて軽く撹拌，そのまま冷凍庫内において 30 分間放置する．
- リンス： 吸引して上澄の アセトン を取り除く． PB にて 15 分間，室温で 1 度だけリンスする（アセトンと塩が反応して沈殿を作るので，これを避けるために行うステップ）．次に，PBS (pH 7.2) にて，２）と同様に 15 分間，室温でリンスする．これを 2 度繰り返す．
- ブロッキング：１ー４.までの段階で準備した細胞懸濁液に 1 ml 程度の 1% Bovine Serum Albumin (BSA) を含む PBS を加え，1 時間室温でインキュベートする．抗体の非特異的吸着を防止する目的で，行うステップであり，簡易的に抗体の性質を確かめる際には省略できるステップである．
- 抗体染色（一次抗体）：１ー４までの段階で準備した細胞を 50 μl 程，上記の小さい試験管，あるいはデプレにとり，同じ量の抗体溶液を加える．最終濃度は従って，準備した抗体濃度の半分になることを注意して抗体溶液を準備する．染色時間は，約１時間，室温で行う．ただし，ものによっては，長時間を要する場合があるので，注意が必要． 抗体は，種類によって希釈率が異なっているので，前もって実験する必要がある．市販のものであれば，予め推薦する希釈率が記載されている．ただし，イムノブロットの場合とは，異なる濃度である（蛍光抗体法の方がより高濃度を必要とする）．
- リンス：PBSにて，２）と同様に 20 分間，室温で 3 回行う．
- 抗体染色（2 次抗体）： 吸引して上澄の PBS を十分に取り除き，これに等量の 1: 50 希釈の 2 次抗体溶液を加える（最終の希釈率は，1：100 程度，購入した抗体により異なるので，推薦される希釈率に調整する）．30〜45 分間室温でインキュベートする．2 次抗体とは，蛍光標識された抗体で，一次抗体と特異的に反応する抗体である．従って，一次抗体が，マウスで作られたものであると，例えばヤギでつくられた，抗マウス抗体（Goat Anti-mouse IgG conjugated with fluorescein, GAM）を購入する．ただし，一次抗体をコンジュゲイションキットで直接蛍光標識する場合，このステップは不要となる．2 次抗体を使う利点は，1 次抗体の標識を増幅出来ることにある（上図参照）．
- リンス: PBS (pH7.2) を ３ ml ほど一気に加え，15 分間，室温で３回リンスする．
- 観察：観察には，蛍光退色防止のために，蛍光退色防止剤 として，右のカラムに記した溶液を使用する．22 x 22 mm のカバーグラスを使用する場合であれば，この体色防止剤を 7.5 μl に対して，7.5 μl の細胞懸濁液を加えると体積的には適性である.
マイクロインジェクション Microinjection
マイクロインジェクションには，倒立顕微鏡（DIAPHOT, Nikon または IX-70, Olympus）に搭載したインジェクション装置（IM 300, Narishige）を使用し，注射の圧力や注射時間を適宜設定し（約 35 psi，10 msec 程度），一回の注射につきゾウリムシの細胞体積の約 5％ 以下 の水滴を注入できるよう調節を行う。 インジェクション用の針は，先端を研磨装置（EG-44, Narishige）により研磨して尖らせ，口径約 5 μm になるよう作成した。他方，ホールド用の針は先端が平らになるよう研磨し，吸い寄せた際に細胞が傷付かないよう，マイクロフォージ（MF-83, Narishige）によって熱を加えて丸め，外径約 50 μm，口径が 20 μm になるよう作成した （下図参照）。
実際のインジェクションにおいては，プラスチックシャーレに細胞が 1 個体収まる様な液敵をマウントし，これをホールディングピペットで吸引保持し，インジェクションピペットを刺入，インジェクションを行う（下図参照）．また，インジェクションした細胞を観察するときは，ディプレッションスライドに，ミネラルオイルを満たし，ここに液滴をプロットすることで，水の乾燥を防ぎ，比較的長い時間，細胞の動きを止めた状態での観察が可能となる．
細胞体積およびインジェクション量の測定：インジェクションを行うには，細胞体積およびインジェクションする液の量を知る必要がある．細胞の体積の推定は，下図の様に，スライドグラスに，予め直径約 20 μm のラテックスビーズ（Polyscience）を塗布しておき，ここに細胞懸濁液を載せてカバーグラスで押しつぶす．細胞を楕円形と見なして，長径と短径を測定し，表面積を計算する．この値に，厚さである 20 μm を乗じることで細胞体積を推定する．また，インジェクションする液滴は，ミネラルオイル中で，インジェクションしたときに，針先に生じた水滴の直径を測定し，球の体積の計算を行うことで求める
実際のインジェクションにおいては，プラスチックシャーレに細胞が 1 個体収まる様な液敵をマウントし，これをホールディングピペットで吸引保持し，インジェクションピペットを刺入，インジェクションを行う（下図参照）．また，インジェクションした細胞を観察するときは，ディプレッションスライドに，ミネラルオイルを満たし，ここに液滴をプロットすることで，水の乾燥を防ぎ，比較的長い時間，細胞の動きを止めた状態での観察が可能となる．
細胞体積およびインジェクション量の測定：インジェクションを行うには，細胞体積およびインジェクションする液の量を知る必要がある．細胞の体積の推定は，下図の様に，スライドグラスに，予め直径約 20 μm のラテックスビーズ（Polyscience）を塗布しておき，ここに細胞懸濁液を載せてカバーグラスで押しつぶす．細胞を楕円形と見なして，長径と短径を測定し，表面積を計算する．この値に，厚さである 20 μm を乗じることで細胞体積を推定する．また，インジェクションする液滴は，ミネラルオイル中で，インジェクションしたときに，針先に生じた水滴の直径を測定し，球の体積の計算を行うことで求める
図 P. multimicronucleatum のミトコンドリア分画の電子顕微鏡像 A, 低倍率観察像．白いサークル（○）で囲まれた部分が，ミトコンドリアである．直径も比較的大きく，形がはっきりしている．ミトコンドリアと共に，破壊されてしまった細胞内小器官の残骸，ペルオキシソーム（白いアローヘッド）のような構造も観察された．B, 強拡大したミトコンドリアの電子顕微鏡写真．直径約１μmの小胞状の構造の内部には，原生動物のミトコンドリアに特徴的な管状のクリステが観察される．尚，スケールはともに，1 μmである．
REFERENCES
REFERENCES
- 谷口摩依，峠千尋，槙原尚美，石田正樹 2007. Paramecium におけるミトコンドリア分画単離法の確立. 奈良教育大学附属自然環境教育センター紀要第, 8, 1-8.
- 竹原良記 （2001） 7.1ラット肝ミトコンドリア分離法 In: 内海耕造，井上正康 （監修）, 新ミトコンドリア学, 共立出版. Pp. 382-383.
ミトコンドリア分画の単離法 Isolation Method of Mitochondria Fraction
ミトコンドリア分画の単離にあたっては，ラット肝臓のミトコンドリア分離法（竹原，2001）を改変して Paramecium に適用した．
- 培養した 500 mlの Paramecium 懸濁液を約 80 xg にて軽く遠心し，15 mlに濃 縮する．
- これに最終濃度にして 250 mM の sucrose と 0.1 mM EDTA を含む，10 mM の Tris-HCl 緩衝液（pH 7.2）を加えて遠心し，細胞を 3 回洗浄する．
- さらに，同じ緩衝液により，Paramecium細胞体積の9倍量加えて，超音波破砕機（Branson Ultrasonic Div. of Emerson Japan Ltd., USA）にて数秒間（2〜3秒）細胞を破壊する．
- 破砕液は，80 xg で 7 分間遠心し，破砕されていない細胞や核を分離する．
- エッペンチューブに 350 mM の sucrose sucrose と 0.1 mM EDTA を含む，10mM の Tris-HCl 緩衝液（pH 7.2）を 500 μl 入れたものを準備し，それに遠沈した上清液を 500 μl ずつ重層し，700 xg で 10 分間遠心する．
- 遠心後，上清を取り除いて少量の 250 mM の sucrose と 0.1 mM EDTA を含む，10 mM の Tris-HCl 緩衝液（pH 7.2）を加えてかたまりを溶かさないように注意しながら沈査を洗い，もう一度同じ緩衝液を加えて撹拌懸濁する．
- さらに 7,000 xg で 10 分間遠心処理し，上清を取り除き，沈殿物を少量の 250 mM の sucrose を含む，10 mM の Tris-HCl 緩衝液（pH 7.2）で溶かす．
- もう一度 7,000 xg で 10 分間遠沈した後，上清を取り除き，少量の 250 mM のsucrose を含む，10 mM の Tris-HCl 緩衝液（pH 7.2）に混ぜて最終的なミトコンドリア分画を得る．
- この分画は，-20℃ にて凍結保存する．
図1. P. multimicronucleatumのJC-1およびMitotracker Green FM による蛍光染色像．A, MitoTracker Green FM 染色．500 nM のMitoTracker Green FM により，10 分間染色した結果を示している．ミトコンドリア膜に集積したMitoTracker Green FM の発色が観察される．B and C, JC−１による染色画像. Bは，細胞全体の染色像であり，Cは，細胞表層を強拡大した像である．尚，スケールバーは，それぞれ，A および B が 20 μm を C が 10 μm を示している．
図 2 P. multimicronucleatumのミトコンドリア分画の蛍光染色像．A, Mitotracker Green FM による染色像。精製したミトコンドリア分画を 500 nMのMito Tracker Green FMにより，10 分間染色した結果を示している。ミトコンドリア膜に集積した MitoTrackerGreen FM の発色が観察される。B and C, JC-1 による染色画像. B, U-MWIGフィルターによる赤色蛍光の観察。C, U-MNIBA フィルターによる緑色蛍光の観察。Bの白いアローヘッドで示しめした部分に JC-1 の集積を示す赤色蛍光が観察される。しかしながら，C に示した同じ部分での緑色蛍光は観察されない。尚，スケールバーは，50 μm である。
REFERENCES
REFERENCES
- Fok A.K. and Allen R.D. (1988) The lysosome system. In: Görtz, H.D. (ed.), Paramecium. Springer-Verlag, Berlin. Pp. 301-324.
- Kobayashi T. and Endoh H. (2003) Caspase-like activity in programmed nuclear death during conjugation of Tetrahymena thermophila. Cell Death Differ. 10(6): 634-640.
- 谷口摩依，峠千尋，槙原尚美，石田正樹 2007. Paramecium におけるミトコンドリア分画単離法の確立. 奈良教育大学附属自然環境教育センター紀要第, 8, 1-8.
ミトコンドリアの染色 Mitochondria Staining
ミトコンドリアを特異的に染色するの2つ蛍光色素，5,5,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetaethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide （JC-1）（Molecular Probes, Inc., Netherlands）および MitoTracker Green FM（Molecular Probes, Inc., Netherlands）を使用した．これらの蛍光色素は，100％ dimethylsulfoxide (DMSO) に溶解させ，使用時の DMSO 濃度は，0.1％以下となるように調整した．JC-1 は，陽イオン性の蛍光色素であり，膜電位依存性にミトコンドリアへ蓄積される．この蓄積された状態では，赤色の蛍光を示し，一方，分散した状態では緑色へ放射蛍光色を転換する．緑から赤へ蛍光放射波長が変化することにより，ミトコンドリアの局在状態をモニターでき，他の陽イオンの染料より過分極に対するその反応がより一貫しているという特性を持つ．一方，MitoTracker Green FM は，液体状では発色しないが，ミトコンドリアの脂質部分に集積された場合のみ，緑色の放射蛍光をもつようになるという特徴をもつ．
MitoTracker Green FMミトコンドリアを標識するためには 500 nM において，わずか 10 分間の染色時間で十分であった．図 1A には，MitoTracker Green FM による細胞の染色像を示している．図 1Aに示したように，JC-1と同様に，細胞表層に点在する無数のミトコンドリアと，食胞と考えられる染色像が得られた．
JC-1生細胞において, Paramecium 内のミトコンドリアを標識するためには，1.5 μM において 24 時間以上が必要とされることが判った．図 1Bと1Cに，JC-1により蛍光染色された細胞の像を示している．図 1B は，生きた細胞の染色像であるが，細胞表層に小さな顆粒状の標識と，細胞質中に比較的大きな球形の染色像が得られた．小胞のサイズは，ほぼ 5〜20 μmのサイズを持つことから，おそらくは，既存の食胞が染色されているものと考えられた（Fok and Allen, 1988）．図 2C は，JC-1 染色した細胞の表層を示しているが，直径約 1 μm の小さな顆粒の染色が観察される．上述した電子顕微鏡で観察されるミトコンドリアの直径に等しいサイズである．JC-1 は投与直後に，こうした食胞に集積される傾向があり，このため，比較的長い染色時間を必要とするものと考えられた． JC-1 と MitoTracker Green FM により染色される食胞の数には違いがみられた．MitoTracker Green FM の場合が数個であるのに対して，JC-1の場合は数十個に及ぶ．一細胞中に形成される食胞の数は，食胞形成 1 サイクルに必要とされる時間 （約 30-40 min）と単位時間あたりの食胞形成率（1 DV/min）から計算すると，約 30-40 個であるので（Fok and Allen, 1988），JC-1の場合は，細胞質中のほとんど全ての食胞が標識さている事になる． Kobayashi T. and Endoh H. (2003) の報告によると，JC-1による Tetrahymena 細胞の染色においても，食胞への取り込みが観察されており，JC-1に関しては，細胞膜を通過して取り込まれるのでは無く，食胞膜を介して細胞質に導入されている可能性が推測され，このことが染色に必要とされる時間の差をもたらしている可能性が考えられた．
単離されたミトコンドリア分画の染色先の結果から得られた最適濃度を参考にして，最終濃度にして1.5 μMのJC-1を，500 nM のMitoTracker Green FMを用いて染色を行った．分離したミトコンドリアを染める場合には，しかしながら，JC-1の場合であっても長い染色時間を必要としなかった．図3には，JC-1およびMitoTracker Green FMを，室温にて10 分間処理した後，7000 x gで10 分間遠心，洗浄を3度繰り返し，ミトコンドリアを蛍光顕微鏡で観察したものを示している．観察の結果，MitoTracker Green FMで染色した側（図2A）では，ミトコンドリアはきれいに染色され，MitoTracker Green FMが集積して緑色蛍光を呈している像をはっきりと観察することができた．他方，JC-１で染色した側（図 2B，C）では，アローヘッドで示した部分に，JC-１の強い赤色発色が観察された（図 2B）．JC-１は，ミトコンドリアのような膜電位をもつ小胞内部に集積された状態では赤色の発色を示し，分散した状態では緑色の発色を呈する．図 2B からわかるように，写真右肩の構造物に JC-１ の赤い蛍光が観察されるが，緑色蛍光（図 2C）はほとんど観察されない．おそらくは，ミトコンドリアに集積された JC-1 の蛍光発色と考えられる．JC-1 により染色したミトコンドリア分画を細胞内部に導入した場合，この赤い蛍光で示されるミトコンドリア分画が，細胞内消化により消化されると，一転して緑色の蛍光で観察されるようになる．
MitoTracker Green FMミトコンドリアを標識するためには 500 nM において，わずか 10 分間の染色時間で十分であった．図 1A には，MitoTracker Green FM による細胞の染色像を示している．図 1Aに示したように，JC-1と同様に，細胞表層に点在する無数のミトコンドリアと，食胞と考えられる染色像が得られた．
JC-1生細胞において, Paramecium 内のミトコンドリアを標識するためには，1.5 μM において 24 時間以上が必要とされることが判った．図 1Bと1Cに，JC-1により蛍光染色された細胞の像を示している．図 1B は，生きた細胞の染色像であるが，細胞表層に小さな顆粒状の標識と，細胞質中に比較的大きな球形の染色像が得られた．小胞のサイズは，ほぼ 5〜20 μmのサイズを持つことから，おそらくは，既存の食胞が染色されているものと考えられた（Fok and Allen, 1988）．図 2C は，JC-1 染色した細胞の表層を示しているが，直径約 1 μm の小さな顆粒の染色が観察される．上述した電子顕微鏡で観察されるミトコンドリアの直径に等しいサイズである．JC-1 は投与直後に，こうした食胞に集積される傾向があり，このため，比較的長い染色時間を必要とするものと考えられた． JC-1 と MitoTracker Green FM により染色される食胞の数には違いがみられた．MitoTracker Green FM の場合が数個であるのに対して，JC-1の場合は数十個に及ぶ．一細胞中に形成される食胞の数は，食胞形成 1 サイクルに必要とされる時間 （約 30-40 min）と単位時間あたりの食胞形成率（1 DV/min）から計算すると，約 30-40 個であるので（Fok and Allen, 1988），JC-1の場合は，細胞質中のほとんど全ての食胞が標識さている事になる． Kobayashi T. and Endoh H. (2003) の報告によると，JC-1による Tetrahymena 細胞の染色においても，食胞への取り込みが観察されており，JC-1に関しては，細胞膜を通過して取り込まれるのでは無く，食胞膜を介して細胞質に導入されている可能性が推測され，このことが染色に必要とされる時間の差をもたらしている可能性が考えられた．
単離されたミトコンドリア分画の染色先の結果から得られた最適濃度を参考にして，最終濃度にして1.5 μMのJC-1を，500 nM のMitoTracker Green FMを用いて染色を行った．分離したミトコンドリアを染める場合には，しかしながら，JC-1の場合であっても長い染色時間を必要としなかった．図3には，JC-1およびMitoTracker Green FMを，室温にて10 分間処理した後，7000 x gで10 分間遠心，洗浄を3度繰り返し，ミトコンドリアを蛍光顕微鏡で観察したものを示している．観察の結果，MitoTracker Green FMで染色した側（図2A）では，ミトコンドリアはきれいに染色され，MitoTracker Green FMが集積して緑色蛍光を呈している像をはっきりと観察することができた．他方，JC-１で染色した側（図 2B，C）では，アローヘッドで示した部分に，JC-１の強い赤色発色が観察された（図 2B）．JC-１は，ミトコンドリアのような膜電位をもつ小胞内部に集積された状態では赤色の発色を示し，分散した状態では緑色の発色を呈する．図 2B からわかるように，写真右肩の構造物に JC-１ の赤い蛍光が観察されるが，緑色蛍光（図 2C）はほとんど観察されない．おそらくは，ミトコンドリアに集積された JC-1 の蛍光発色と考えられる．JC-1 により染色したミトコンドリア分画を細胞内部に導入した場合，この赤い蛍光で示されるミトコンドリア分画が，細胞内消化により消化されると，一転して緑色の蛍光で観察されるようになる．
200 mM Cacodylate Buffer (CB） (pH 7.2) Na(CH3)2AsO2：4.8 gDDW：83.1 ml 0.1 M HCl：16.8 mlpHは確認が必要
2％ Gultaraldehyde (GA) in CB 200 mM CB： 17.5 ml70% GA：2.0 mlDDW：50.5 ml4℃ で ３ ヶ月保存可
2％ OsO44% OsO4：2.0 mlDDW：2.0 ml蒸気だけでも固定出来る程，強い固定材でるので，蒸気が逃げぬ様パラフィルムでシールし，更に別の容器の中に２重に封入して，4℃ で保存．
REFERENCES
2％ Gultaraldehyde (GA) in CB 200 mM CB： 17.5 ml70% GA：2.0 mlDDW：50.5 ml4℃ で ３ ヶ月保存可
2％ OsO44% OsO4：2.0 mlDDW：2.0 ml蒸気だけでも固定出来る程，強い固定材でるので，蒸気が逃げぬ様パラフィルムでシールし，更に別の容器の中に２重に封入して，4℃ で保存．
REFERENCES
- Reynolds, E.S. (1963) The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol., 17,208-212.
- Watson, M.L. (1958) Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. J. Biophys Biochem Cytol., 25, 727-730.
電子顕微鏡試料作成 Preparation for TEM
- 化学固定: 2重固定法を用いる．
- 寒天包埋：ミトコンドリア分画の様に小さいサンプルを観察する場合には，寒天包埋を行う。約 50℃ までに冷ました 2％ 寒天溶液を少量加えて固化させた．固化後，実体顕微鏡下で，カミソリにて約 1 mm 角のブロック状に切断する．
- 脱水：水溶液中の試料を脂溶性の樹脂に包埋する為には，まず水溶液をアルコールと置換し，さらにアルコールや脂溶性の樹脂と親和性のあるプロピレンオキサイドに置換しなければならない．だだし，直接置換すると，化学固定を施したとはいえ，浸透圧により細胞が変形してしまう恐れがある．この為，数段階の脱水処理が必要となる． 脱水は，エタノールシリーズ（50％-70％-90％-95％-100％）により行う．それぞれの段階における脱水処理は，各10分であり，100％ エタノールにおいては操作を2回繰り返す．さらに，プロピレンオキサイドで 2 回，同様な操作をくり返す．
- 樹脂包埋：エポキシ系樹脂，Quetol 812（日新EM社）を用いる．樹脂溶液は，9 ml Quetol 812，3 ml DDSA（硬化剤），6.23 ml MNA（硬化剤），0.36 ml DMP-30を含んでいる．包埋に際しても，段階的に樹脂とプロピレンオキサイトを置換する方法を取る．まず樹脂溶液とプロピレンオキサイドを 1:1 で混合したものにより，1 時間半震盪する．次に，樹脂溶液とプロピレンオキサイドを 3:1 で混合したものにより 3 時間震盪する，さらに，樹脂溶液のみにより，2 時間震盪する．最後に，樹脂溶液のみにて一晩震盪し，このままチューブに入れ硬化させる．
- 樹脂の硬化：35℃で一晩，45℃で一晩，60℃でさらに一晩の計 3 日行う（あるいは，80℃ over night）．
- 超薄切片作成：ガラスナイフメーカー，Knife Maker TYPE7801B（LKB, SWEDEN）を使用して，ガラスナイフを作成する．ガラスナイフをミクロトーム，ULTRACUT E（Reichert-JUNG, Germany）に載せて，厚さ約 90 nm 平均の超薄切片を得る．銅製の１スロットメッシュ（日新EM㈱, JAPAN）にホルムバールの支持膜を貼ったものを用意し，このメッシュに超薄切片を載せる．
- 電子染色：最も一般的な染色法である 3％ 酢酸ウラニル水溶液（Watson, 1958）と硝酸鉛溶液（Reynolds, 1963）による 2 重染色を行う．染色は室温で行い，それぞれ，7 分間と 3 分間である．
- 観察：メッシュを透過型電子顕微鏡 H-7000（Hitachi, JAPAN）にセットして 75 kV にて観察，写真撮影を行う．
Materials
全ての作業は，プラスティックグローブを着用し，コンタミネーションに注意する．液を混合する時は，タンパク質を壊さぬ様注意して，泡を立てないようにすること．
0.5 M EDTA (pH 8.0) EDTA：93.06 gMQW：400 mlNaOH：10 gpH を 5 N NaOH で調整後，MQW で，500 ml までメスアップ．
5x TBE Tris：54 gBoric acid：27.5 g0.5 M EDTA (pH 8.0)：20 mlMQWで 1,000 ml にメスアップ短いDNA分離に適している
10x TAETris：48.4 g氷酢酸：11.4 ml0.5 M EDTA (pH 8.0)：20 mlMQWで 1,000 ml にメスアップ長いDNA分離に適しているグラスミルクを用いたDNAに用いる.
Gel Loading Buffer Bromophenol Blue：0.25%Xylene cyanol FF：0.25%EDTA (pH 8.0)：1 mM Sucrose：40% (or Glycerol 50%)実際には，Nakarai Cat# 253-54 を使っている
EtBr 染色液Ethidium Bromide：50 μgNaOH：50 mM 溶け難いので，1 時間程撹拌する．溶けたものは，ゲルが入る程のタッパに入れ，さらに真鍮の弁当箱等に入れて，遮光保存する．協力な発癌作用と毒性があるので注意，取扱いには必ず手袋を着用すること．
中性平衡化フェノール中山広樹・西方敬人 1995.バイオ実験イラストレイテッド①分子生物学の基礎．秀潤社，東京．
10 M 酢酸アンモニウムAmmonium Acetate：77.0 gMQW で100 ml にメスアップ．
3 M 酢酸ナトリウムSodium Acetate (NaOAc): 20.4 gMQW：40 mlpHを氷酢酸で pH 5.2 に調整し，50 ml までメスアップ．
1x TE (pH 7.0)Tris-HCl：10 mM EDTA：1 mM
20x SSC (pH 7.0)NaCl：350.6 gSodium Citrate・2H2O：176.4 gMQW：1,600 mlpH を NaOH で調整し, 2,000 ml までメスアップ．
Salmon Sperm DNAGibco BRL の Cot 1 （反復配列を多く含む）を加えて Pre-annealing させることで，Blocking をすることが可能である．
サケのように系統的に離れていて，比較的 Hybridization を邪魔しないと考えられるDNAを加えることで，安価に代用している．
この行程はしかしながら，Telomere の様な反復配列を標識したい場合は，かえって感度を下げてしまうことになる.
HEM buffer (pH 7.0)Hepes：50 mMEGTA：10 mMMgCl2：2 mM
TBT (pH 7.2)Tween 20： 0.1%bovine serum albumin (BSA) ： 1% Tris-HCl (pH 7.2)：10 mMNaCl： 150 mM
TBS buffer (pH 7.2)Tris-HCl：10 mMNaCl： 150 mM
Rinse SolutionsRinse には，次の 3 種類のリンス溶液を作成する．
Rinse Soln. 1 75 ml Formamide 15 ml 20x SSC 60 ml DDWWater Bath 43℃で保温
Rinse Soln. 2 6 ml 20x SSC 144 ml DDW Water Bath 61℃で保温 Rinse Soln. 3 30 ml 20x SSC 120 ml DDW 150 μl Tween 20Water Bath 43℃で保温
Blocking Buffer3% BSA4x SSC0.1% Tween 200.22 μm のミリポアフィルターで濾過できる様に注射器にセットし，4℃で保存．
Detection Buffer1% BSA4x SSC0.1% Tween 200.22 μm のミリポアフィルターで濾過できる様に注射器にセットし，4℃で保存．FITC-Avidin 2 mg/ml をDetection Buffer で 1: 400 に希釈するRhodamin-anti DIG 200 μg/ml の場合は，1: 100 に希釈
蛍光退色防止剤0.233 g DABCO 800 μl DDW200 μl 1 M Tris HCl9 ml Glycerolアルミホイルを掛けて，4℃ で保存．
1 M Tris-HCl (pH 8.0)Tris：121.1 gMQW：800 ml
HCl で pH を調整し，1,000 ml まで，メスアップ．
1x TE (pH 7.0)Tris-HCl：10 mM EDTA：1 mM
10x TE (pH 7.0)Tris-HCl：100 mM EDTA：10 mM
- Pipette Tip w/ filter (滅菌）
- Plastic Globe
- Mili Q Water (MQW, 超純水)
全ての作業は，プラスティックグローブを着用し，コンタミネーションに注意する．液を混合する時は，タンパク質を壊さぬ様注意して，泡を立てないようにすること．
0.5 M EDTA (pH 8.0) EDTA：93.06 gMQW：400 mlNaOH：10 gpH を 5 N NaOH で調整後，MQW で，500 ml までメスアップ．
5x TBE Tris：54 gBoric acid：27.5 g0.5 M EDTA (pH 8.0)：20 mlMQWで 1,000 ml にメスアップ短いDNA分離に適している
10x TAETris：48.4 g氷酢酸：11.4 ml0.5 M EDTA (pH 8.0)：20 mlMQWで 1,000 ml にメスアップ長いDNA分離に適しているグラスミルクを用いたDNAに用いる.
Gel Loading Buffer Bromophenol Blue：0.25%Xylene cyanol FF：0.25%EDTA (pH 8.0)：1 mM Sucrose：40% (or Glycerol 50%)実際には，Nakarai Cat# 253-54 を使っている
EtBr 染色液Ethidium Bromide：50 μgNaOH：50 mM 溶け難いので，1 時間程撹拌する．溶けたものは，ゲルが入る程のタッパに入れ，さらに真鍮の弁当箱等に入れて，遮光保存する．協力な発癌作用と毒性があるので注意，取扱いには必ず手袋を着用すること．
中性平衡化フェノール中山広樹・西方敬人 1995.バイオ実験イラストレイテッド①分子生物学の基礎．秀潤社，東京．
10 M 酢酸アンモニウムAmmonium Acetate：77.0 gMQW で100 ml にメスアップ．
3 M 酢酸ナトリウムSodium Acetate (NaOAc): 20.4 gMQW：40 mlpHを氷酢酸で pH 5.2 に調整し，50 ml までメスアップ．
1x TE (pH 7.0)Tris-HCl：10 mM EDTA：1 mM
20x SSC (pH 7.0)NaCl：350.6 gSodium Citrate・2H2O：176.4 gMQW：1,600 mlpH を NaOH で調整し, 2,000 ml までメスアップ．
Salmon Sperm DNAGibco BRL の Cot 1 （反復配列を多く含む）を加えて Pre-annealing させることで，Blocking をすることが可能である．
サケのように系統的に離れていて，比較的 Hybridization を邪魔しないと考えられるDNAを加えることで，安価に代用している．
この行程はしかしながら，Telomere の様な反復配列を標識したい場合は，かえって感度を下げてしまうことになる.
HEM buffer (pH 7.0)Hepes：50 mMEGTA：10 mMMgCl2：2 mM
TBT (pH 7.2)Tween 20： 0.1%bovine serum albumin (BSA) ： 1% Tris-HCl (pH 7.2)：10 mMNaCl： 150 mM
TBS buffer (pH 7.2)Tris-HCl：10 mMNaCl： 150 mM
Rinse SolutionsRinse には，次の 3 種類のリンス溶液を作成する．
Rinse Soln. 1 75 ml Formamide 15 ml 20x SSC 60 ml DDWWater Bath 43℃で保温
Rinse Soln. 2 6 ml 20x SSC 144 ml DDW Water Bath 61℃で保温 Rinse Soln. 3 30 ml 20x SSC 120 ml DDW 150 μl Tween 20Water Bath 43℃で保温
Blocking Buffer3% BSA4x SSC0.1% Tween 200.22 μm のミリポアフィルターで濾過できる様に注射器にセットし，4℃で保存．
Detection Buffer1% BSA4x SSC0.1% Tween 200.22 μm のミリポアフィルターで濾過できる様に注射器にセットし，4℃で保存．FITC-Avidin 2 mg/ml をDetection Buffer で 1: 400 に希釈するRhodamin-anti DIG 200 μg/ml の場合は，1: 100 に希釈
蛍光退色防止剤0.233 g DABCO 800 μl DDW200 μl 1 M Tris HCl9 ml Glycerolアルミホイルを掛けて，4℃ で保存．
1 M Tris-HCl (pH 8.0)Tris：121.1 gMQW：800 ml
HCl で pH を調整し，1,000 ml まで，メスアップ．
1x TE (pH 7.0)Tris-HCl：10 mM EDTA：1 mM
10x TE (pH 7.0)Tris-HCl：100 mM EDTA：10 mM
FISH 法 Fluorescent In Situ Hybridization
１）PCR Gibco BRL kit を用いて， 以下の順に混ぜ合わせ，最終量が 100 μl となる様に調整する。
1. SDW (sterilized MQW) 70.5 μl 2. 10x PCR buffer 10 μl 3. 50 mM MgCl2 3 μl 4. 1% W-1 (w/ stabilizer) 5 μl 5. dNTP 10 μl 6. Probe (10 μM) 1 μl 7. Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.5 μlPCR のサイクルは以下の順に行わせる. 7 cycles: 94℃ 30 sec - 50℃ 30 sec - 72℃ 30 sec 10 cycles: 94℃ 45 sec - 55℃ 45 sec - 72℃ 45 sec 10 cycles: 94℃ 60 sec - 60℃ 60 sec - 92℃ 60 sec 30 cycles: 94℃ 90 sec - 65℃ 90 sec - 92℃ 90 sec PCR 後に PCR products を数 μl 分取して，1% Agarose gel（500〜7,000 bp が分離できる） で電気泳動し，確認する．
２）Agarose Gel electrophoresis1% アガロース（35-37℃ melt. point, Takara）を予め 0.5xTBE あるいは 1xTAE に入れ，電子レンジで（空気が逃げれるように軽くラップして，吹きこぼれない様に見ながら）溶かし作成しておく． これを 0.5xTBE あるいは 1xTAE で満たした Mupid (ADVANCE) にこれをセットする．
３）Phenol Extraction （フェノール抽出）100 μl の PCR products に，同量の 中性平衡化フェノール（Nakarai，バイオ実験イラストレイテッドを参照）を加えVoltex で均質な乳液状態まで撹拌する．
４）Ethanol Precipitation（エタノール沈殿）100 μl の フェノール抽出した PCR products に，1/5 量（20 μl）の 10 M 酢酸アンモニウム（pH 5.2，dNTPの除去の目的．通常は，3 M 酢酸ナトリウムで良い）を加え，さらに，2.5 倍量（250 μl）のエタノールを加え， Voltex で撹拌する．
５）Estimation of DNA concentration （DNA 濃度の推定）既知濃度の λDNA（Takara） を比較対象として，簡単な濃度推定を行う．50, 100, 200, 400, ng/μl に希釈した λDNA を 1 μl づつパラフィルムの上に液滴としてプロットする．1 μl の 5x ゲルローディングバッファーと 3 μl の MQW を加え，Pipette tip（イエローチップ）で良く混ぜる．
６）Nick translation Boehringer Nick translation kit を用いて， 以下の順に混ぜ合わせ，最終量が 50 μl となる様に調整する。
FISH （Day 1）
７）Denaturation of DNA probe残りの 42 μl から，8 μl 分取し，これに以下のものを加え，良く撹拌する．但し，ピペットで撹拌しては行けない．DNA を傷つける可能性があり，タッピングで良い． 1. 8 μl Salmon Sperm DNA (1 μg/μl） 2. 1.6 μl 3 M Sodium Acetate (1/10 amount of total DNA) 3. 40 μl Ethanol
８）Cell Preparation
１０）Hybridization
１１）Rinse
１２）Detection
1. SDW (sterilized MQW) 70.5 μl 2. 10x PCR buffer 10 μl 3. 50 mM MgCl2 3 μl 4. 1% W-1 (w/ stabilizer) 5 μl 5. dNTP 10 μl 6. Probe (10 μM) 1 μl 7. Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.5 μlPCR のサイクルは以下の順に行わせる. 7 cycles: 94℃ 30 sec - 50℃ 30 sec - 72℃ 30 sec 10 cycles: 94℃ 45 sec - 55℃ 45 sec - 72℃ 45 sec 10 cycles: 94℃ 60 sec - 60℃ 60 sec - 92℃ 60 sec 30 cycles: 94℃ 90 sec - 65℃ 90 sec - 92℃ 90 sec PCR 後に PCR products を数 μl 分取して，1% Agarose gel（500〜7,000 bp が分離できる） で電気泳動し，確認する．
２）Agarose Gel electrophoresis1% アガロース（35-37℃ melt. point, Takara）を予め 0.5xTBE あるいは 1xTAE に入れ，電子レンジで（空気が逃げれるように軽くラップして，吹きこぼれない様に見ながら）溶かし作成しておく． これを 0.5xTBE あるいは 1xTAE で満たした Mupid (ADVANCE) にこれをセットする．
- パラフィルムの上で，上記の 数 μl の PCR products と，その 1/5 量のゲルローディングバッファーを液滴としてそれぞれプロットし，Pipette tip（20 μl 用イエローチップ）で良く混ぜる．
- ゲルのウェル（ゲルの櫛穴）にサンプルを静かに入れる．この時，1 μl の1 kb Ladder (250 μg/μl, Gibco BRL) をマーカーとして別のウェルにも入れておく（基本的には，8 個ある穴に全てサンプルあるいはマーカーが入っている状態がスマイリングを妨げる）．
- 100 V で〜1 hr 泳動し，ローディングバッファーの色が，ゲルの 2/3 程度流れた所で，泳動を止める．
- ゲルを取り出し，15 分間以上室温で，EtBr 染色する．染色後に，サランラップを敷いた（消毒用のエタノールで霧吹きし，その上に敷くと密着する），トランスイルミネーター上にのせて UV 照射し，撮影する．
- 撮影が済んだゲルは，サランラップごと漏れない様にまとめて，焼却する様にするか，あるいは，キッチン漂白剤（次亜塩素酸を含むもの）のバケツに入れて無毒化する．
３）Phenol Extraction （フェノール抽出）100 μl の PCR products に，同量の 中性平衡化フェノール（Nakarai，バイオ実験イラストレイテッドを参照）を加えVoltex で均質な乳液状態まで撹拌する．
- 15,000 rpm で 2 分間遠沈し，上層と中層をピペットで回収し，50 μl の 中性平衡化フェノールと 50 μl の CIA（Chloroform: Isoamylalcohol = 24 : 1） を加え同様に Voltex で撹拌する．
- 更に 15,000 rpm で 2 分間遠沈し，上層と中層をピペットで回収し，100 μl の CIA を加え，Voltex で撹拌する．
- 最後に上層のみを回収する．
４）Ethanol Precipitation（エタノール沈殿）100 μl の フェノール抽出した PCR products に，1/5 量（20 μl）の 10 M 酢酸アンモニウム（pH 5.2，dNTPの除去の目的．通常は，3 M 酢酸ナトリウムで良い）を加え，さらに，2.5 倍量（250 μl）のエタノールを加え， Voltex で撹拌する．
- 20 分間，-20℃で DNA を沈殿させる．
- 15,000 rpm で 20 分間遠沈し，上澄を捨て，1 ml の 70% エタノールを加え，Voltex で撹拌する．
- 15,000 rpm で 20 分間遠沈し， 上澄みを捨て風乾する．風乾は，吸引装置のついたデシケーターで，10 分間吸引しながら乾燥させる．あまり乾燥させすぎると，TE に溶かすに時間がかかるので，10 分間とすること．
- 10 μl のTE を加え，軽くピペッティングにより溶解させる．
５）Estimation of DNA concentration （DNA 濃度の推定）既知濃度の λDNA（Takara） を比較対象として，簡単な濃度推定を行う．50, 100, 200, 400, ng/μl に希釈した λDNA を 1 μl づつパラフィルムの上に液滴としてプロットする．1 μl の 5x ゲルローディングバッファーと 3 μl の MQW を加え，Pipette tip（イエローチップ）で良く混ぜる．
- ３）および４）を経て得られた PCR products を， 1 μl 分取し，これに 1 μl の 5x ゲルローディングバッファーと，3 μl の MQW を加え， Pipette tip（イエローチップ）で良く混ぜる．
- ゲルのウェル（ゲルの櫛穴）にそれそれのサンプルを静かに入れる．
- 100 V で数分（約 10 min）泳動し，1 cm 程で泳動を止める．EtBr 染色し，濃度を比較する．
６）Nick translation Boehringer Nick translation kit を用いて， 以下の順に混ぜ合わせ，最終量が 50 μl となる様に調整する。
- SDW (sterilized MQW) 24.5 μl
- 10 x Nick translation buffer 5 μl
- dAGC 5 μl
- Biothin-16-dUTP 2 μl (Roche, GmbH, Germany)
- d-Mercaptoethanol 5 μl
- Probe DNA (250 μg/μl) 4 μl
- Polymerase (2.5 U) 2 μl (Roche, GmbH, Germany)
- 1/50 DNase I (Final 1 μg/ml ) 2.5 μl (TaKaRa, Osaka, JAPAN)
- Nick translation は，DNAase 添加から始まる．温度制御装置付きのCool Water Bath で，15 ℃，2 hr 処理する．
- 8 μl 分取し, 10 分間ボイルする（この処理で，DNAは開列する）．
- 氷上で熱を冷まし， 15,000 rpm で 2 分遠心する．
- 2% Agarose Gel 電気泳動にて，得られたプローブのサイズを同定する．
- 8 μl Probe に 2 μl の 5xローディングバッファー加えイエローチップで混ぜる．
- 1 kb Ladder をマーカーとして 3 μl (150 ng/μl) 用い，電気泳動する．
- Biotin 化された Probe は，500 bp より小さいので，これを確認する．
- 8 μl 分取した残りの 42 μl は，68℃ で 15 分間ヒートブロック処理後，-20℃で保存する．
FISH （Day 1）
７）Denaturation of DNA probe残りの 42 μl から，8 μl 分取し，これに以下のものを加え，良く撹拌する．但し，ピペットで撹拌しては行けない．DNA を傷つける可能性があり，タッピングで良い． 1. 8 μl Salmon Sperm DNA (1 μg/μl） 2. 1.6 μl 3 M Sodium Acetate (1/10 amount of total DNA) 3. 40 μl Ethanol
- -20℃で，20 分間 インキュベートする．
- 15,000 rpm で 20 分間，−4℃の冷却遠心する．
- 上澄の Ethanol を捨て，吸引デシケーター中で 10 分間乾燥させる．
- 以下の二つをピペッティングにより良く撹拌する（over 100 times）
- Voltex 室温で，20 分間（この間に，細胞のDenature を開始するので，長くても構わない）
- Water Bath 中で，75〜80℃ 10 分間インキュベートする．この行程により，DNAが開列するので，10 分以下は不可である．
- 氷上で急速に 2~3 分間冷却し， 15,000 rpm で数秒，0℃ の冷却遠心をする．（結露を落とす意味）これを Hybridization に用いる．
８）Cell Preparation
- 細胞を 3% の Formaldehyde を含む HEM を用いて，10 分間室温で固定する．
- HEM により，3 回洗浄する
- 1 ml の 50 μg/ml の Protainase K (Merck, Darmstadt, Germany) を含む TBT を加え，8 分間，37℃で処理する．
- 上澄を捨て，10 ml の 4℃に冷やした TBS を加え，20 分間 4℃ で放置する．
- 上澄を捨て， 10 ml の TBS を加え，室温で 20 分間の洗浄を 2 回繰り返す。
- 細胞を再び 3% の Formaldehyde を含む TBS を用いて 30 分間室温で固定する．
- 10 ml TBS で，3 回洗浄し，最後に DDW で洗浄する．
- 細胞は，シランコートされたスライドグラス（Dako, Kyoto, Japan）にのせ，室温 で乾燥し，乾燥剤とともに -20℃ で保存した．
- -20℃ に冷やした 70% Ethanol で満たしたコプリンジャーで，5 分間冷却する．
- 90% Ethanol で満たしたコプリンジャーで，5 分間室温で放置する。
- 100% Ethanol で満たしたコプリンジャーで，5 分間室温で放置する。
- スライドグラスを取り出し，室温で 30 分間，風乾する．
１０）Hybridization
- 16 μl のDNA Probe をカバーグラスにのせる．この時泡が立たない様に注意する．
- カバーグラスは，机においたままにして，９）で準備したスライドグラスをこれに被せる様にして，くっ付ける。
- カバーグラスの周りに，コクヨのペーパーボンドで，シーリングする．
- モイストチャンバーに，2x SSC を満たし，この中で，18〜24 時間 37℃ でインキュベートする．
１１）Rinse
- 37℃ のインキュベーターから，Hybridization したスライドグラスを取り出す。
- ペーパーボンドのシールをピンセットで剥がし，ピンセットでカバーグラスを慎重に剥がす．
- スライドグラスを 43℃ の Rinse Soln. 1 に浸け，Rotaly Shaker で 5 分間震盪する．
- Rinse Soln. 1 を入れ替えて，さらに 5 分間震盪，これを全部で 3 回繰り返す．
- スライドグラスを 61℃ の Rinse Soln. 2 に浸け，同様に震盪しながら 3 回洗う．
- 150 μl の Bloking Buffer を載せ，50 x 24 mm のカバーグラスをかけて，30 分間 37℃で上述のモイストチャンバー中でインキュベートする．
１２）Detection
- このステップは全て，部屋の明かりを落とした状態でやること。
- スライドグラスを傾けて，カバーグラスを落とす．
- 150 μl の Detection Buffer (5 μg/ml FITC-Avidin を含む) を載せ，新しい 50 x 24 mm のカバーグラスをかけて 30 分間 37 ℃ モイストチャンバー中でインキュベート．
- 43℃ の Rinse Soln. 3 に浸け， Dark Box をかけて，震盪しながら，3 回洗う．
- カウンターステインニングとして，20 ng/ml DAPI in 2x SSC 中で，5 分間 Dark Box をかけて，震盪する．
- 1/2 に希釈した Rinse Soln. 3 (Used で構わない) で 2 分間室温で，震盪する．
- 蛍光退色防止剤を 40 μl スライドグラスに載せ， 50 x 24 mm のカバーグラスをかけてネイルエナメルでシールする．その際，余分な蛍光退色防止剤は，ろ紙で吸い取り，また，泡を入れない様に封入する．
Genomic DNA 単離法 Genomic DNA Isolation Method
Genomic DNA は，plasmid DNA や RNA に比べて非常に長いので，物理的に切断され易い．撹拌するときは，泡立てたりすることがない様，穏やかに転倒混合すること．また，イエローチップなどの先端は，予め切り取り，先端口径を大きくする等の工夫が必要である．
核酸濃度測定
上のステップ9）で得られた O.D. の値に希釈倍率の逆数をかければ元のサンプルの濃度が測定できる。つまり O.D. の値に 100 をかけるのであるが，この時さらに，核酸の濃度を算定するための補正値を掛け合わせたものを，最終的には O.D. の値にかける。 O.D.260 ÷ O.D.280 = 1.8〜2.0 になっていれば，核酸の純度は高い。低ければ，フェノールやタンパクのコンタミが考えられる。
- 細胞を Soldo Salt Solution (SSS, マイクロインジェクションの項を参照) で 3 回洗浄する。洗浄に際しては，15 ml の遠心用試験管中に，細胞懸濁液を入れ，手回し遠心機にて，20 回遠心し，細胞が試験管の底に集まった所で，上澄みを捨て，次いで SSS (Soldo Salt Solution, pH7.0) を 10 ml 程度注ぎ，再び遠心する．この操作を 3 度繰り返し，最終的に 細胞のペレットを得る．
- 細胞のペレットに対して，約 10 倍量の 10x TE を加えて，穏やかに懸濁する．
- 10% SDS (in MQW) を final 1% になる様に加えて，静かに転倒混和する．
- 更に，10 mg/ml の proteinase K (in MQW)(Merck, Darmstadt, Germany) を final 100 μg/ml となる様に加え，静かに混和する。
- 55℃ で 2 hr 以上緩やかに震盪する（over night 可）．
- 等量の TE-saturated phenol （中性平衡化フェノール）を加え，静かに 30 分以上震盪する。
- 14,000 rpm 10 分 （3,000 rpm, 20 分）遠心し，上澄を新しい tube に回収する．
- 等量の chloroform を加え，白濁するまで穏やかに撹拌する．
- 14,000 rpm 10 分 （3,000 rpm, 20 分）遠心し， 上澄を新しい tube に回収する．
- 1 mg/ml の RNase を final 10 μg/ml になる様に加え，泡立てない様に緩やかに撹拌する．
- 37℃ で，1 hr 以上静置する．
- 10% SDS (in MQW) を final 0.5% になる様に加える．
- 更に， 10 mg/ml の proteinase K を final 100 μg/ml となる様に加え．
- 55℃ で 1 hr 以上緩やかに震盪する．
- 等量の phenol を加え，穏やかに 30 分以上震盪する．
- 14,000 rpm 10 分 （3,000 rpm, 20 分）遠心し，上澄を新しい tube に回収する．
- 等量の chloroform を加え，白濁するまで穏やかに撹拌する．
- 14,000 rpm 10 分 （3,000 rpm, 20 分）遠心し，上澄を新しい tube に回収する．
- 1/10 量の 3 M NaOAc と 2.5 倍量の EtOH を加えて，穏やかに混和する．
- 14,000 rpm 10 分 （3,000 rpm, 20 分）遠心し，上澄を捨てる．
- 70％ EtOH を加えて，14,000 rpm, 1 分（ 3,000 rpm, 2 分）遠心し，上澄を捨てる.
- ピペットで丁寧に余剰の EtOH を取り除き，風乾する．風乾は，吸引装置のついたデシケーターで，10 分間吸引しながら乾燥させる．あまり乾燥させすぎると，TE に溶かすに時間がかかるので，10 分間とすること．
- 100 μl TE に再溶解（50℃ 程度で 10 分）し，吸光度を測定する．
核酸濃度測定
- SHIMADZU UV-1600 のスイッチを入れる.
- 奥の試料フォルダー（リファレンス）に蒸留水を入れたセルをセットする。
- 手前の試料フォルダー（核酸測定用）に蒸留水をいれたセルをセットする。
- １.フォトメトリックを選ぶ。
- Go to WL (wave length) を押す。波長を 260 nm にセットする。
- Auto Zero を押す。30 分間程度，光源が安定するのを待つ。
- Auto Zero を押す。
- 手前の試料フォルダーに核酸溶液（2 μl サンプル + 198 μl DDW）をいれ，蓋をしめる。
- 計測されたO.D.の値を読み取る。
- サンプルはエッペンチューブに戻し，セルを蒸留水で３回洗う。
- Go to WL (wave length) を押す。波長を 280 nm にセットする。
- 手前の試料フォルダー（核酸測定用）に蒸留水をいれたセルをセットする。
- Auto Zero を押す。
- 手前の試料フォルダーに先ほどエッペンにとっておいた核酸溶液（2 μl サンプル + 198 μl DDW）をいれ，蓋をしめる。
- 計測された O.D. の値を読み取る。
上のステップ9）で得られた O.D. の値に希釈倍率の逆数をかければ元のサンプルの濃度が測定できる。つまり O.D. の値に 100 をかけるのであるが，この時さらに，核酸の濃度を算定するための補正値を掛け合わせたものを，最終的には O.D. の値にかける。 O.D.260 ÷ O.D.280 = 1.8〜2.0 になっていれば，核酸の純度は高い。低ければ，フェノールやタンパクのコンタミが考えられる。
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