--光譜儀操作與原理簡介
原理
儀器內部的光源發射出光線。
光線通過燈卡,篩選出該物質最容易吸收的特定波長光線。
光線穿過裝在cuvette裡的液體。如果液體中目標物質的濃度越高,光被吸收得就越多。
光電偵測器測量穿透過去的光強度,與先前校正的初始光強度進行比較,計算出透光度(TR),再換算成吸光度(Abs)顯示在螢幕上。
操作步驟
放入燈卡
準備裝有ddWater的cuvette
把光強度(L)調成100,按歸零
放入裝有待測溶液的cuvette
按下測量,並記錄吸光值(Abs)和透射率(TR)
--實驗:不同波長燈卡吸光值 (cuvette中裝紅墨水)
儀器測量
實驗測量
--實驗:繪製standard curve
R² =0.9904
r = 0.9952
--葉綠體光反應簡介
葉綠體的光反應發生於類囊體薄膜。當光系統Ⅱ(PSⅡ)與光系統Ⅰ(PSⅠ)中的葉綠素分子吸收光能後,外層電子會轉為激發態。在正常情況下,這些激發電子會迅速傳遞給反應中心的電子接受者,啟動電子傳遞鏈。然而,若葉綠素吸收的光能無法順利進入電子傳遞鏈,例如照光過強或電子傳遞受阻,處於激發態的電子就會釋放能量回到基態,其中一部分能量便會以紅色的螢光形式釋放出來。
在正常的能量轉換過程中,由光系統Ⅱ釋出的高能電子會進入類囊體薄膜上的電子傳遞鏈。當電子在不同的電子載體間依序傳遞時,會釋放出能量。細胞利用此能量將基質中的氫離子主動運輸至類囊體腔內,產生質子濃度梯度,驅動類囊體薄膜上的 ATP 合成酶生成 ATP。為了遞補光系統Ⅱ所失去的電子,水分子會被光解分裂,產生電子、氫離子與副產物氧氣。
從光系統Ⅱ流出的電子最終會傳遞至光系統Ⅰ。光系統Ⅰ的葉綠素再次吸收光能並將電子激發,這些電子隨後經由另一段短暫的傳遞過程,與基質中的氫離子一同被傳遞給 NADP⁺,將其還原為具有還原力的 NADPH。透過此電子傳遞鏈的運作,光能被有效轉化為儲存於 ATP 與 NADPH 中的化學能,以供後續的碳反應使用。
圖片來源:https://case.ntu.edu.tw/highscope/%E5%85%89%E5%8F%8D%E6%87%89photosynthesis-light-reactions-%E4%B8%8B/index.html
透過藍光透射儀,可看到葉綠素發射的紅光。高能量的藍光打在葉片,葉綠素躍遷至激發態,多餘的能量會以波長較長、能量較低的紅光釋放。橘色的綠光板可以過濾掉藍光,在清楚觀察的同時,也能避免藍光傷害眼睛。
紅莧菜未照光
紅莧菜照光
葉綠素未照光
葉綠素照光
--葉綠體光反應實驗
原理介紹
DCIP 是一種藍色的氧化還原指示劑,會取代 NADP⁺ 進入電子傳遞鏈,搶先接收光反應所產生的電子。當 DCIP 獲得電子(被還原)後,就會從深藍色轉變為無色。
DCMU是一種常見的除草劑,主要藉由阻斷植物光系統II的電子傳遞鏈,抑制光合作用來發揮作用。
實驗步驟
將研缽放入冰塊中,加入撕碎的紅莧菜葉片與0.5M蔗糖水磨碎。
過濾步驟1.之液體
用蔗糖水稀釋濾液,測量其在590nm的吸光值(A590),使A590落在0.4~0.6(底液)
取一cuvette,加入2mL底液與100μL DCIP,測量A590
將cuvette留在光譜儀中,每30秒記錄一次A590,記錄至2min
重複步驟4.和5.,但用手電筒貼附cuvette照射,每30秒蓋上蓋子紀錄。
重複步驟4.和5.,但再加入DCIP前先加入100μL DCMU反應兩分鐘,再用手電筒照射cuvette。
由於cuvette在全黑的環境下,不會進行光反應,因此DCIP沒有被還原,維持深藍色,吸光值不變。
由於cuvette在有光的環境下,會進行光反應,因此DCIP被還原,顏色變淡,吸光值降低。
加入DCMU後,因DCMU阻斷光反應,因此DCIP不會被還原,吸光值不變。
利用光碟進行分光
這是一堂結合物理與生物的課。早上學習了如何使用光譜儀,並透過對紅墨水進行序列稀釋,計算回歸曲線;下午則探討了葉綠素分子的光物理特性:當其吸收光子受激發後,會透過放熱與發射紅色螢光釋放能量,我們透過藍光透射儀看到了此螢光現象(也順便看了紙鈔和身分證中的螢光纖維)。此外,我們也透過加入DCIP,驗證了光合作用中光反應的電子傳遞鏈。