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マウス初期胚の運命決定
The cell-fate decision in mouse early development
マウス初期胚の運命決定
The cell-fate decision in mouse early development
マウスの受精卵は細胞分裂を繰り返えし、受精後3.5日経つとブラストシストと呼ばれる着床前胚に成長します。その過程では、高度に分化した精子と卵子のエピゲノム状態がリセットされ、多能性幹細胞の性質を獲得することから、リプログラミングと呼ばれます。ブラストシストにはエピブラスト(EPI)、栄養外胚葉(TE)、栄養内胚葉(PE)と呼ばれる、3種類の細胞が存在します。中でもEPIは多能性幹細胞であり、単離培養するとES細胞が樹立できます。私達は、このステージの細胞運命決定が、どのように制御されているかをエピジェネティクスに注目して研究しています。
Mouse fertilized eggs undergo repeated cell division and develop into a pre-implantation embryo called a blastocyst by 3.5 days after fertilization. During this process, the highly differentiated epigenetic states of the sperm and oocyte are erased, and the cells establish a new epigenetic landscape to pluripotentcy, a process known as reprogramming. The blastocyst contains three types of cells: the epiblast (EPI), the trophectoderm (TE), and the primitive endoderm (PE). Among these, the EPI consists of pluripotent stem cells, which is an origin of embryonic stem (ES) cells. We are focusing on epigenetics to study how cell fate determination at this stage is regulated.
受精直後のマウス着床前胚は、リプログラミングが起きる神秘的なステージです。この時期のクロマチンには、我々の想像を超えるような出来事が連続して起こっており、多くの謎に包まれています。
The mouse pre-implantation embryo, just after fertilization, is a fascinating stage where reprogramming occurs. During this period, the chromatin undergoes a series of events beyond our imagination, and much of it remains shrouded in mystery.
技術開発を通したアプローチ
Technical development
技術開発を通したアプローチ
Technical development
私達のこだわりの一つは、技術開発です。従来の技術では解析できなかったようなクロマチンイベントを、新たしい技術を開発することによって、独自のアプローチで研究します。自分のとっておきのアイディアを楽しみながら磨くことによって、技術革新に繋がるような仕事を目指します。これまでに我々が開発した技術を以下に紹介します。
One of the key focuses of our research is technical development. We aim to explore chromatin events, that could not be analyzed with conventional methods, by developing new technologies. By refining and enjoying our best ideas, we strive to achieve work that leads to technological innovation. Below are some of the techniques we have developed so far.
MeFISH (Nuc. Acid Res, 2013)
エピジェネティクス修飾の一つであるDNAのメチル化は、転写反応などのゲノム機能と密接に関わっています。これまで、DNAのメチル化状態を解析するためには、DNAを化学処理（バイサルファイト処理)し、その我々はシーケンスを読んでいました。この方法では、細胞からDNAを抽出する必要があるため、サンプルの空間情報が失われてしまいます。そこで私達は、組織切片上で標的DNA配列のメチル化状態をイメージングするMeFISH法を開発しました。
DNA methylation, one of the key epigenetic modifications, is closely associated with genomic functions such as transcription. Traditionally, to analyze the DNA methylation state, genomic DNA extracted from cells had to undergo chemical treatment (bisulfite conversion), and sequencing was then performed. In contrast, we developed a method called MeFISH, which allows for imaging the methylation state of target DNA sequences on tissue sections.
TGV (Nature Strucral Molecular Biology, 2013)
人口DNA結合タンパク質TALEを応用することで、生きた細胞内で標的ゲノム配列を光らせる技術(TGV, TALE-mediagete Genome Visualization)を開発しました。クロマチンの核内動態は転写活性にも深く関与しており、TGVを使うことで様々なDNA(例えば、父方および母方の染色体)をライブイメージングすることもでき、世界中の多くの研究プロジェクトで使われています。
We developed a technique called TGV (TALE-mediated Genome Visualization), which uses artificial DNA-binding proteins, TALEs, to label target genomic sequences within live cells. The nuclear dynamics of chromatin are deeply involved in transcriptional regulation. TGV allowe us to live-image various DNA sequences including paternal and maternal chromosomes and is widely used in research projects around the world.
ALaP-seq (Molecular Cell 2020)
転写制御の解析にはクロマチン免疫沈降法(ChIP-seq)が広く使われていますが、PML bodyのように液-液相分離するような核内構造体は不溶性なためChIP-seqで解析することができません。そこで私達は、ALaP-seq (APEX-mediated chromatin labeling and purification)を開発しました。APEXの近接空間ラベル技術を応用したもので、目的因子がどのゲノム領域と相互作用しているかを、NGSを使ってゲノムワイドに同定できます。
Chromatin immunoprecipitation (ChIP-seq) is widely used for the analysis of transcriptional regulation. This technique uses antibodies to immunoprecipitate target proteins, but nuclear structures such as PML bodies, which undergo liquid-liquid phase separation, are insoluble and cannot be analyzed by ChIP-seq. To address this, we developed ALaP-seq (APEX-mediated chromatin labeling and purification). By applying APEX's proximity labeling technology, this method allows for genome-wide analysis using NGS to determine which genomic regions interact with specific factors.
改良型ATAC-see (Nature Genetics 2024)
タンパク質の「ゲノムDNAへの結合のしやすさ」はクロマチン-アクセシビリティと呼ばれ、遺伝子の転写活性、DNAの複製反応などのゲノム機能に関与しています。私達は、改良型ATAC-seeを開発することで、より高感度にアクセシビリティをアクセシビリティを蛍光イメージングすることが可能になりました。ATAC-seeを駆使することで、アクセシビリティを制御する因子の同定にも成功しています。
The 'binding' of proteins to genomic DNA is referred to as chromatin accessibility, which plays a crutial role in genomic functions such as gene transcription, DNA replication, and repair. By developing an improved version of ATAC-see, we made it possible to fluorescently image chromatin accessibility with higher sensitivity. Utilizing ATAC-see, we have also successfully identified factors that regulate accessibility.
細胞の可塑化 (Nature Genetics 2024)
Cas9や山中因子を細胞に発現させても、標的DNAのアクセシビリティが低いためうまく結合できません。私達が同定したアクセシビリティ制御因子TFDP1をノックダウンすると、アクセシビリティがゲノムワイドに上昇します。これを利用してアクセシビリティを人為的に操作することで、本来ゲノムDNAが持つポテンシャルを引き出す（可塑化する）ことができ、ゲノム編集やiPSリプログラミングの効率を高めることに成功しています。
Even when Cas9 or Yamanaka factors are expressed in cells, they cannot bind effectively to their target DNA due to the low accessibility. Knockdown of TFDP1, an accessibility-regulating factor we identified, increase chromatin accessibility in a genome-wide manner. By artificially manipulating accessibility in this way, we unlocked the inherent potential of genomic DNA (make it more plastic), and have successfully improved the efficiency of genome editing and iPS cell reprogramming.
クロマチン-アクセシビリティ
Chromatin accessibility
クロマチン-アクセシビリティ
Chromatin accessibility
真核生物のゲノムDNAは、ヒストン８量体に巻き付いてヌクレオソームを形成する。そのヌクレオソームは、メチル化やアセチル化などの化学修飾を受けることで、転写や複製などの様々なゲノム機能を制御している。ゲノムDNAの大部分はヌクレオソームによって覆われているが、プロモーターやエンハンサーなどの転写制御領域はヌクレオソーム構造を取らず、裸の状態で存在する。裸のゲノム領域は、転写因子などのDNA結合タンパク質が直接結合（アクセス）できるため、アクセシブル-クロマチンと呼ばれる。アクセシブル-クロマチンは、ゲノム上で起こる様々な反応の足場であり、ゲノム機能に必要不可欠な要素である。アクセシブル-クロマチンの構築は細胞特異的な遺伝子発現に必須であり、その破錠はガンを含めた様々な疾患を引き起こす。
私達は、「クロマチン-アクセシビリティがどのように制御され、それが細胞運命決定にどう寄与するか」を明らかにしたいと思っています。これまでに、核内構造体PML bodyによるクロマチン-アクセシビリティの制御様式を明らかにしました（Mol Cell, 2020)。また、ATAC-seeとCRISPRゲノムワイドスクリーニングを組み合わせることで、アクセシビリティを制御する新規因子を複数同定することに成功し、TFDP1の分子機能を明らかにしました(Nat.Genetics, 2024)。この様に、クロマチン-アクセシビリティは、従来考えられていたよりも遥かに複雑なメカニズムで制御されています。私達は、アクセシビリティの制御機構に挑むことで、細胞運命決定に隠された神秘に迫ろうとしています。
In eukaryotes, genomic DNA wraps around a histone octamer to form nucleosomes. These nucleosomes undergo chemical modifications, such as methylation and acetylation, which regulate various genomic functions like transcription and replication. While the majority of genomic DNA is covered by nucleosomes, transcriptional regulatory regions such as promoters and enhancers remain nucleosome-free and exist in a bare state. These bare genomic regions are referred to as accessible chromatin, as they allow direct binding (access) of DNA-binding proteins such as transcription factors. Accessible chromatin serves as a scaffold for various genomic reactions and is an essential component of genome function. The establishment of accessible chromatin is critical for cell-specific gene expression, and its disruption can lead to various diseases, including cancer.
We aim to uncover 'how chromatin accessibility is regulated and how it contributes to cell fate determination.' We have previously elucidated the mechanism by which the nuclear structure PML body regulates chromatin accessibility (Mol Cell, 2020). Additionally, by combining ATAC-see with CRISPR genome-wide screening, we successfully identified several novel factors that regulate accessibility and clarified the molecular function of TFDP1 (Nat. Genetics, 2024). This research shows that chromatin accessibility is regulated by mechanisms far more complex than previously thought. By tackling the regulatory mechanisms of accessibility, we are striving to unravel the hidden mysteries of cell fate determination.
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