When - alignment and phylogeny

Allineamento di sequenze

L'allineamento multiplo di sequenze di geni o proteine permette di valutarne la similarità ed identificare porzioni di sequenza conservate fra diverse specie. In genere le regioni più conservate ricoprono importanti ruoli funzionali e sono utili per comprendere il funzionamento della proteina codificata e l'impatto delle variazioni proteiche. Le proteine presentano specifiche regioni più conservate, che sono essenziali per una specifica funzione, definite domini funzionali. Le proteine che condividono un medesimo meccanismo funzionale e peculiari caratteristiche di sequenza sono riunite in gruppi funzionali detti famiglie proteiche (famiglie geniche).

A causa delle ridondanza del codice genetico (molte triplette possono codificare per uno stesso aminoacido), in genere le sequenze di mRNA divergono più in fretta di quelle proteiche nel corso dell'evoluzione.

Esercizio 1. Allineamento multiplo di sequenze (geni o proteine). E' possibile utilizzare due diversi approcci:

• Allineamento globale. Si tenta di ottimizzare l'allineamento complessivo di tutta la sequenza. In genere utilizzato per poche sequenze e con buon livello di similarità. Provare ad utilizzare Clustal Omega per allineare le sequenze di mRNA e proteine del gene CFTR di uomo, scimpanzè e topo, forniti in questi files. Copiare le sequenze nella casella "sequences" e cliccare il pulsante "submit" al fondo della pagina per avviare l'allineamento.

• Allineamento locale. Si cercano all'interno della sequenza regioni con elevata similarità, massimizzando l'allineamento in queste regioni. Utili per sequenze molto divergenti e distanti evolutivamente. Provare ad utilizzare Blast per allineare le sequenze di mRNA e proteina del gene CFTR (usare le sequenze salvate in precedenza o quelle qui riportate). Utilizzare Blast nucleotide per mRNA e Blast protein per proteina. Copiare la sequenza nel box in alto "FASTA sequence" e cliccare il pulsante "BLAST" per avviare l'allinemento contro il database delle sequenze note dei trascritti o proteine. Provare ad inserire un organismo specifico nel box "organism" per verificare i risultati su una determinata specie o gruppo tassonomico.

Il gioco interattivo PHYLO permette di cimentarsi con allineamenti multipli, in competizione con gli altri utenti e comprendere rapidamente i meccanismi alla base dell'allineamento di geni in specie differenti.

Geni ortologhi in specie diverse

Due geni che codificano per una proteina corrispondente in specie diverse sono definiti ortologhi, mentre geni codificanti proteine analoghe derivati dalla duplicazione di uno stesso gene all'interno di uno organismo sono definiti paraloghi. Il sequenziamento di numerose specie animali ha permesso l'identificazione degli ortologhi lungo l'albero evolutivo (analisi filogenetica) e la costruzione di alberi filogenetici che illustrano la diffusione e divergenza di un gene fra le diverse specie

Esercizio 2. Utilizzare Genomicus per visualizzare geni ortologhi del gene CFTR (o un altro gene di interesse) nelle diverse specie. Immettere il gene di interesse e selezionare "Homo Sapiens" dal menù a tendina. Cliccare "Go" per avviare l'analisi. I risultati mostrano l'albero filogenetico delle diverse specie. Il gene di interesse è al centro ed i box circostanti rappresentano gli altri geni presenti nella stessa zona per valutare la sintenia. Selezionando in alto "Protein similarity" è possibile ottenere una colorazione in funzione del grado di similarità delle sequenza del gene nelle diverse specie.

Ma quanto sono distanti evolutivamente 2 specie? Provate a recuperare questa informazione ad esempio per uomo (Homo sapiens) e zebrafish (Danio Rerio) utilizzando il portale TimeTree. Utilizzate la funzione "GET DIVERGENCE TIME FOR A PAIR OF TAXA".

Additional exercise. Le analisi filogenetiche hanno importanti applicazioni anche in ambito medico per mappare l'origine dei ceppi infettivi comparando le sequenze degli agenti patogeni campionati in diverse aree geografiche ed in diversi pazienti. Provare ad esplorare la diversità e l'origine dei ceppi di Ziks virus ed Ebola virus sul portale Nextstrain.

Studio degli ortologhi in modelli animali

Lo studio dei geni ortologhi in modelli animali può fornire importanti informazioni sul ruolo dei geni e permettere di comprendere il loro funzionamento nell'uomo. A questo scopo sono stati intrapresi progetti di caratterizzazione a tappeto in diversi modelli (es. topo e zebrafish) in cui ogni singolo gene viene disattivato per studiarne le conseguenze biologiche.

Esercizio 3. Consultare il portale Mouse Genome Informatics per recuperare informazioni sul gene CFTR in mouse. E' possibile cercare inserendo il nome del gene nel box "QuickSearch" e premendo il pulsante. Il link diretto alla caratterizzazione del gene è raggiungibile qui. Sono riassunti tutti i dati principali sull'espressione del gene ed i fenotipi rilevati in topi knock-out (in cui il gene è stato inattivato).