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Quand utilise-t-on un microscope à deux photons ?
Quand utilise-t-on un microscope à deux photons ?
- Seulement si un échantillon (ou organisme entier) dépasse les 50 µm en profondeur. Sinon, un microscope confocal est souvent meilleur en résolution latérale et axiale.
- La microscopie à deux photons marche mieux dans les milieux diffusants comme nos tissus. Nous utilisons la fenêtre de transparence des tissus entre 700 - 1300 nm pour aller plus profondément. La profondeur est au maximum de 1 mm dans un tissu peu diffusant. Si nécessaire, la PF possède un 'pulse peaker', qui permet d'aller plus profondément. Voir ci-dessous les paramètres qui déterminent la profondeur d'excitation Zmax.
- Avec la PF, nous pouvons atteindre une distance de travail importante et aller jusqu'à 8 mm dans un objet 'transparent'.
- Nos résultats sont de belles images: standard 512x512 pixels ou des mosaïques en 2D et en 3D.
Microscope à deux photons: TriM Scope II, LaVisionBioTec
Microscope à deux photons: TriM Scope II, LaVisionBioTec
Equipements complémentaires
Equipements complémentaires
Pour les études in vivo :
- MouseOx monitoring: saturation en O2 d’hémoglobine, fréquence cardiaque et respiratoire...
- Tapis électrique chauffant avec 'feed-back' pour stabiliser la température de l'animal à 36°-37° C.
- Cadre stéréotaxique fait-maison pour immobiliser la tête d'un animal sous l'objectif.
- Petite salle de chirurgie petit animal, avec plusieurs postes d’anesthésie isoflurane, fraise dentaire pour craniotomie, microscope binoculaire NIKON...
- Petits équipements pour la préparation de colorants: balance de précision, bain ultrason, plaque chauffante..
- Pompe de perfusion et d'extraction.
Pour les études in vitro sur cultures cellulaires et tissu perfusé :
- Un incubateur Okolab pour microscope droit: 'stage top chamber'.
Pour la sélection de vos colorants demandez de l'aide. Ci-dessous quelques références pour faciliter votre choix. En règle générale: plus le GM (two-photon absorption cross section) est élevé, meilleur sera le rapport signal sur bruit dans vos images pour une durée d'acquisition correcte dans le vivant < 1s.
Pour la détection synchrone de plusieurs colorants, on vous aidera.
La puissance de notre laser en fonction des longueurs d'ondes et les colorants associés.
La puissance de notre laser en fonction des longueurs d'ondes et les colorants associés.
Quelques exemples d'images de microscopie à deux photons
Quelques exemples d'images de microscopie à deux photons
Résultats imagerie en 3D des sphéroïdes avec cellules cancéreuses:
image: Abbas Mgharbe, BvdS, Hélène Delanoe-Ayari, Jean-Paul Rieu
voir https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2765233/pdf/zpq17271.pdf
image: Florence Appaix
Analyse pour l'entreprise CYTOO
voir: http://journals.sagepub.com/doi/pdf/10.1177/2211068215607058
Régénération en 3D des neurones dans les gels d'acide hyaluronique.
La profondeur d'image à gauche est de 2 mm.
image: Lauriane Hamard, BvdS
voir : https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acsami.6b06446
Étude ex vivo de la distribution des nanoparticules USPIO dans une plaque d'athérome.
Le signal rouge indique les particules USPIO au sein des macrophages. Le signal bleu = fibres de collagène type 1 et 3. Le signal turquoise = fibres d’élastine.
image: Florence Appaix et BvdS
cf.: http://www.nanomedjournal.com/article/S1549-9634(15)00171-9/pdf
Coloration ex vivo et in vivo des astrocytes dans tout le cerveau par injection i.v. de sulfo-rhodamine B.
Les signaux rouges sont les astrocytes marqués par SRB et les signaux verts, la vascularisation cérébrale après injection i.v. de FITC-dextran 70kDa.
images: Florence Appaix, BvdS
cf.: http://journals.plos.org/plosone/article/file?id=10.1371/journal.pone.0035169&type=printable
Validation d'une nouvelle sonde proche infrarouge pour la microscopie intravitale de la vascularisation cérébrale.
Image: Florence Appaix, BvdS
voir:
Exemple d'une étude in vivo pour analyser la biodistribution d'un nanoparticules (NP) dans une tumeur cérébrale U87MG.
Les signaux rouges sont les NP dans les cellules tumorales et le signal vert ou jaune la vascularisation fonctionnelle après injection i.v. de FITC-dextran.
Attention la tumeur a poussé sous-cutanée dans l'oreille de la souris et l'étude est complètement non invasive.
Images: BvdS
Étude en cours
Effet de la radiothérapie par microfaisceaux sur la paroi artérielle. Analyse d'épaisseur de 'tunica media' dans le temps par microscopie à 2hv in vivo et ex vivo.
Image : BvdS
voir: https://hal.archives-ouvertes.fr/inserm-00589287
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