1. Toma de muestras de suelo.
2. Determinación de la composición de las muestras de suelo.
3. Siembra de mejorana y tomillo.
4. Recogida de plantas autóctonas y trasplante a tierra contaminada.
5. Determinación de la composición final de suelo y plantas.
Para el muestreo de suelo:
12 botes pequeños de plástico.
2 cajas de plástico de 30L de capacidad.
Pala.
Rotuladores permanentes.
Equipo de protección: traje, mascarilla, gafas, gorro y guantes.
2. Para preparar las muestras para su envío al CEBAS-CSIC de Murcia:
Cucharillas de plástico desechables.
Papel de filtro.
Báscula.
Pinzas.
Bolsas zip de tamaño pequeño, previamente identificadas.
0,5 g de cada muestra de suelo.
3. Para plantar las semillas:
Una maceta con tierra comercial para macetas (compo sustrato universal).
Una maceta con tierra de la zona estudiada (no contaminada).
Tres macetas con tierra contaminada de la zona.
Semillas de mejorana (Origanum majorana).
Semillas de tomillo (Thymus vulgaris).
Pala.
4. Para la recogida en la zona de plantas autóctonas:
Bolsas zip de dos tamaños (pequeño y mediano, aprox 1L) previamente identificadas.
Guantes.
Pala.
5. Para trasplantar las plantas recogidas en la zona de estudio:
Macetas con tierra contaminada.
Equipo protector: gafas, mascarilla y guantes.
Pala.
6. Para el análisis final de la composición de las muestras de suelo y las plantas:
Ejemplares recogidos (hojas y raíces).
Muestras de suelo.
Tamiz.
Molinillo de café.
Mortero.
Cucharas de plástico.
Tubos Eppendorf.
Sobres de papel medianos.
Rotulador permanente.
Secador.
Microondas (Mars Xpress; CEM, Mattheus, NC, USA).
Espectrómetro de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP 7000 DUO; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
HNO3 y HCLO4 (proporción 2:1).
Toma de muestras de suelo:
Se realiza la toma de muestras de suelo de las diferentes zonas de la mina Mónica mostradas en la imagen. Del muestreo se recogen:
- 6 botes pequeños de plástico del camino.
- 4 botes pequeños de plástico de la zona más contaminada, junto a la torre de la mina.
- 2 botes pequeños de plástico de control de la zona, justo al inicio de la ruta (aparcamiento).
Los tubos se marcan con sus respectivas coordenadas y se identifican de la siguiente forma: camino= CAM (nº) (Ej: CAM 1), zona más contaminada= TM (nº) + distancia respecto a TM1 en metros (Ej: TM2 + 4m) y control de la zona = CONTROL. Una vez conocidos los resultados del contenido de arsénico de las muestras, se diferencia entre zona 1 y zona 2. La zona 1 es la parte contaminada y la zona 2 la no contaminada, incluyendo la zona control. Se recogen en TM4 + 11 m unos 8 kilos de tierra, la cantidad necesaria para sembrar aproximadamente 8 macetas. Previamente se deja secar la tierra sin tapar. 15 Se recogen también plantas con raíz. En concreto, de la zona control (área azul), se recoge un ejemplar de Lavandula stoechas ¹ . Entre CAM 1 y CAM 6 (área negra) se toman otras seis plantas. Finalmente, en la zona de muestreo del área roja, se toma un ejemplar, un brote de pino (Pinus sp.) ¹.
2. Determinación de la composición de las muestras de suelo
Se homogeneizan las muestras de suelo y se toman 0,5 gramos de cada una de ellas. Se ponen en bolsas pequeñas con cierre zip. Para cada muestra se utilizan utensilios desechables diferentes para evitar contaminación cruzada. Las muestras se numeran mediante un sistema de colores, según su zona de recogida
- Rojo para la zona más contaminada.
- Azul para la zona control.
- Negro para el camino.
Se envían las 12 muestras preparadas al Instituto de Investigaciones CEBAS-CSIC de Murcia, donde se determinan y cuantifican los elementos químicos presentes por espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente.
3. Siembra de mejorana y tomillo
Se hacen dos estudios paralelos:
- Se siembra en tierra, de diferentes grados de contaminación, mejorana y tomillo.
- Se trasplantan a tierra contaminada los ejemplares de mejorana una vez que han germinado en tierra normal.
Se siembra tomillo y mejorana en tres macetas con tierra muy contaminada, recogida en TM 4 + 11 m, cada uno. En cada maceta se ponen tres semillas en forma de triángulo. Se rotulan las macetas, se marca la especie y se anota la fecha de siembra. Como control, se siembra una maceta de tomillo y otra de mejorana, en tierra recogida en la zona sin contaminación. Se rotulan ambas con la especie y la fecha de siembra. También se siembra una maceta de cada especie en sustrato comercial y se rotulan con el nombre de la especie. Una parte de los brotes que crecen en tiestos de sustrato comercial se trasplanta a la tierra contaminada.
4. Recogida de plantas autóctonas y trasplante a tierra contaminada
Posteriormente se realiza una segunda y última salida a zona de la mina de Bustarviejo, donde se recogen algunos ejemplares de varias especies. Dichas especies están en una área contaminada, desde un punto medio de CAM 5 y CAM 4 hasta CAM 3 según el muestreo de la primera salida. Se extrae la planta con la raíz y se toma una muestra del suelo junto a la planta, si no estaba en un lugar donde ya se habían tomado muestras del suelo anteriormente, y se toman las coordenadas para establecer la correspondencia con las primeras muestras.
Algunos de los ejemplares que se cogen se trasplantan para observar si son fitorremediadoras o simplemente muestran contaminación foliar. Entre los ejemplares se encuentran una clavelina (Dianthus lusitanus), un helecho (Pteridium aquilinum) (Bonnier y Layens, 1999), un tomillo (Thymus sp.), un marrubio (Marrubium vulgare) ¹ y un cantueso (Lavandula stoechas). Se esperan dos meses para que los ejemplares trasplantados crezcan y sea posible el análisis de su contenido en metales.
5. Determinación de la composición final de suelo y plantas
En el centro de investigaciones CEBAS-CSIC de Murcia, se preparan las muestras de plantas, se separan hojas, tallo y raíz y se trituran por separado, en un molinillo de café, y se homogenizan. Se toman como mínimo 40 mg de cada órgano y planta y se numeran las muestras. Los restos de las diferentes partes de las plantas se guardan en bolsas de plástico, previamente marcadas. En caso de que se necesite más cantidad de la obtenida con la molienda, la muestra se muele con el mortero y/o se tamiza.
Las muestras sólidas se diluyen en una disolución ácida de HNO3 y HCLO4, en proporción 2:1, enrasada a 25 mL, y se introducen en un microondas, a 230ºC, para la digestión. Posteriormente se introducen en un espectrómetro de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP, de Inductively Coupled Plasma) que nebuliza la muestra y la pasa al estado plasma, para así poder medir las longitudes de ondas que son emitidas por los diferentes átomos. A partir de éstas se obtiene el contenido de las muestras en arsénico, entre otros elementos químicos, expresado en mg·kg⁻¹.
REFERENCIAS
1. Bonnier, G. y Layens, G. (1999) Claves para la determinación de plantas vasculares: para encontrar fácilmente los nombres de las plantas sin términos técnicos. Traducido por X. Baulies, M. Giralt, L. Pineda, F. X. Sans, M. M. Sanz e I. Soriano. Edición revisada por M. I. Gutiérrez Villarias y J. Homet García-Cernuda. Barcelona: Ediciones Omega. 4a reimpresión, 2002. ISBN: 84-282-0796-8.