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授課教授:藍忠昱教授
授課教授:藍忠昱教授
壹、課程內容
一.與微生物有關的歷史
*古代釀造酒或發酵麵包
*雷文霍克觀察並描述酵母菌 原生動物......等微生物
*巴斯德確認了酒精發酵與酵母的關係
二.什麼是微生物
*Microbiology微生物學:Micro代表Mikros=small(微小)
bio代表bios=life (生命)
logy代表logos (科學)
*包含細菌 原生生物 藻類 病毒 真菌 (其中含有酵母菌和黴菌)
*最大的有1cm (華麗琉珠菌) 最小的有200nm(Ultra-small bacteria)
三.細菌的特性
*原核生物
*單細胞生物
*比一般真核細胞小
*大多數細菌微球狀桿狀或是螺旋狀
貳、實驗樣本與器材
一、簡單染色(simple staining)
*結晶紫 (crystal violet)
*水
*酒精燈
*微量分注器
*顯微鏡
*拭鏡紙
*吸水紙
*載玻片
*蓋玻片
*大腸桿菌菌體
*微量滴管
*鏡油
二、革蘭氏染色 (Gran’s staining)
*結晶紫 (crystal violet)
*水
*碘液
*95%酒精
*番紅
*酒精燈
*微量分注器
*顯微鏡
*拭鏡紙
*吸水紙
*載玻片
*蓋玻片
*大腸桿菌菌體
*枯草桿菌菌體
*微量滴管
參、實驗原理
一、簡單染色(simple staining)
因為細菌的核酸和細胞壁的某些成分帶負電，對鹽基鹽的正電荷有強烈的吸引力和結合力
二、革蘭氏染色 (Gran’s staining)
革蘭氏染色原理在於細菌細胞壁的脂質含量差異 。 所有細菌先染成紫色關鍵在於95%乙醇脫色步驟 : 陽性菌脂質少，細胞壁因脫水封閉微孔而保留紫色 陰性菌脂質高，細胞壁被溶解形成大孔導致脫色，最後吸收複染劑而呈現紅色。 (革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌帶差別在於革蘭氏陰性菌有外膜 (外膜主要結構為雙層磷酯質何酯多糖))
肆、實驗步驟
一、簡單染色(simple staining)
1.取一乾淨載玻片，並取5μm水塗抹於載玻片
2.用微量滴管尖取少量菌體小心塗抹於玻片上，並僅量將菌體打散抹開
3.拿著玻片邊緣將塗抹菌液的區域來回通過酒精燈上方，直到水分蒸發
(1-3稱為熱固定法)
4.在載玻片上滴一滴結晶紫(Crystal violet )並等40秒
5.用ddH2O沖洗過多染劑 (注 y 不可直接沖洗菌體)
6.用擦手紙擦乾底部，並蓋上蓋玻片
7.在顯微鏡下先用4倍物鏡找到菌體，再用100倍油鏡觀察並拍照紀錄
二、革蘭氏染色 (Gran’s staining)
1.取一乾淨載玻片，並取5μm水塗抹於載玻片
2.用微量滴管尖取少量菌體小心塗抹於玻片上，並僅量將菌體打散抹開
3.拿著玻片邊緣將塗抹菌液的區域來回通過酒精燈上方，直到水分蒸發
(1-3稱為熱固定法)
4.在載玻片上滴結晶紫(Crystal violet)並等10秒(初染)
5.用ddH2O沖洗過多染劑 (注:不可直接沖洗菌體)
6.在載玻片上滴碘液並等10秒(媒染)
7.用ddH2O沖洗過多染劑 (注:不可直接沖洗菌體)
8.在載玻片上滴95%酒精並等10秒(去染)
9.用ddH2O沖洗過多染劑 (注:不可直接沖洗菌體)
10.在載玻片上滴番紅並等10秒(反染)
11.用ddH2O沖洗過多染劑 (注:不可直接沖洗菌體)
12.用擦手紙擦乾底部，並蓋上蓋玻片
13.在顯微鏡下先用4倍物鏡找到菌體，在用100倍油鏡觀察，並拍照紀錄
伍、實驗結果
一、簡單染色(simple staining)
(圖一)大腸桿菌(簡單染色)(較密集)
(圖二)大腸桿菌(簡單染色)(較分散)
二、革蘭氏染色 (Gran’s staining)
(圖三)枯草桿菌(革蘭氏染色)(較密集)
(圖四)枯草桿菌(革蘭氏染色)(較分散)
(圖五)大腸桿菌(革蘭氏染色)(較密集)
(圖六)大腸桿菌(革蘭氏染色)(較分散)
陸、實驗紀錄與檢討
今天的實驗課是我第一次使用 100 倍油鏡與操作革蘭氏染色法。剛開始因為酒精脫色時間掌控不佳，導致第一次嘗試時樣品過於混濁模糊而失敗；幸好我們迅速檢討問題並重新操作，第二次便順利在油鏡下觀察到清晰且鮮明的細菌形態。
除了技術上的練習，教授在課堂中不斷透過問答引導我們主動思考操作背後的原理，而非盲目照著手冊做。這種高互動的教學方式，不僅幫助我們當場排查出實驗失敗的原因，也讓我對革蘭氏染色的機制有了更深刻的理解，獲益匪淺。
柒、參考資料來源
https://www.scu.edu.tw/microbio/proj/charact/stain/smpl.htm
https://www.scu.edu.tw/microbio/proj/charact/stain/gram.htm
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