Embedded Files
光合作用
授課教授:林立元教授
授課教授:林立元教授
壹、課程內容
一.分光光度計(Spectrophotometer)的構造與原理
*光譜特性包含紫外線(波長短、能量大)及紅外線(對生物傷害低)
*運作流程：光源(白光)→光柵(將白光分色)→狹縫(只允許特定波長通過)→樣品容器→光感測器
*光感測器(偵測器)負責將光訊號轉成電訊號，以便傳遞與計算
*盛裝樣品的容器通透度要好(例如：石英)
二.光碟片產生彩虹(繞射)
*現象：用白光(手電筒)照射光碟片背面會看見彩虹
*原理：光碟片上的密集刻槽，作用如同「光柵」
*機制：光線照射產生「繞射」與干涉，進而把白光分開
光碟繞射產生的彩虹
三.葉綠素發出紅色螢光
*現象：用「藍光」照射葉綠素會發出「紅色螢光」
*過程：葉綠素吸收高能量藍光後，電子跳躍到不穩定的「激發態」
*原理：電子降回「基態」時，釋放出波長較長、能量較低的「紅光」
在藍光下發出紅色螢光的葉子和葉綠素
貳、實驗樣本與器材
*分光光譜儀
*比色管 (Cuvette)
*紅墨水
*微量分注器
*微量滴管
*紅莧菜
*0.05%DCIP
*1mMDCMU
*0.5M蔗糖水溶液
*研缽
*茶葉袋
*燒杯
*量筒
*手電筒
比色管(Cuvette)
分光光譜儀
參、實驗原理
一.比爾-朗伯定律
A=-log I/I0=K×l×c
A :吸光度
I0 : 入射光強度
I : 透射光強度
K:吸收常數
l:吸收介質厚度
c:吸光物質濃度
二.DCIP和DCMU對光反應的影響
1. DCIP (深藍色)在光合作用中可作為氧化劑接受電子傳遞鏈釋出的電子 ， 還原成透明無色的DCIPH2 ， 使透光度上升
2.DCMU會打破光系統II的電子傳遞 x 使光反應無法順利進行
肆、實驗步驟
一.用紅墨水測不同波長燈卡的吸光值
1.插電並打開光譜儀開關
2.用微量分注器吸取2mL的水和紅墨水分別裝入不同比色管中
3.將405nm的燈卡放入光譜儀
4. 將裝有水的比色管放入光譜儀中 ，並將L值轉到100進行校正
5. 將裝有水的比色管取出放入裝有紅墨水的比色管進行測量並記錄
6. 改用波長為470 、 515 、 590 、 615 、 648nm的燈卡重複步驟3~5
二.繪製standard curve
1. 選取1中吸光值最高的燈卡
2. ⽤紅墨⽔:⽔體積比1 :1 (1mL: 1mL) 配置新濃度的紅墨⽔並放入另⼀個比⾊管中
3 .將新配置好的Cuvette放入光譜儀中測量其吸光值並記錄其稀釋倍率為1/2
4 重複步驟3~4三次其稀釋倍率分別為1/4､1/8､1/16､1/32與1/64
5 將數據做成散佈圖並算出R²
不同濃度的紅墨水
三.葉綠體光反應實驗
1. 在黑暗條件下測量吸光值
(1)取2克紅莧菜葉子洗乾淨剝碎放入研缽 ， 置於冰上再加入10mL0.5M蔗糖水溶液磨碎
(2)將粗萃取液到在茶葉袋中進行過濾
(3)將過濾好的粗萃取液放到冰中並且蓋上蓋子避光
(4)取一比色管放入加入葉綠體濾液用0.5M蔗糖溶液稀釋到吸光值約為0.4~0.6
(5)加入100μL DCIP混合均勻
(6)測量A590此為zero time control
(7)將比色管留在光譜儀中 x 每30秒記錄一次A590，記錄至2 分鐘
2.在照光條件下測量吸光值
(1)取2克紅莧菜葉子洗乾淨剝碎放入研缽 ， 置於冰上再加入10mL0.5M蔗糖水溶液磨碎
(2)將粗萃取液到在茶葉袋中進行過濾
(3)將過濾好的粗萃取液放到冰中並且蓋上蓋子避光
(4)取一比色管放入加入葉綠體濾液用0.5M蔗糖溶液稀釋到吸光值約為0.4~0.6
(5)加入100μL DCIP混合均勻
(6)測量A590此為zero time control
(7)用手電筒從上方貼附cuvette照射 ， 每30 sec記錄一次A590 (記錄時要蓋上光譜儀的蓋子)， 記錄至
2 min為止
3. 在照光條件下測量吸光值且在加入DCIP前有加入DCMU
(1)取2克紅莧菜葉子洗乾淨剝碎放入研缽 ，置於冰上再加入10mL0.5M蔗糖水溶液磨碎
(2)將粗萃取液到在茶葉袋中進行過濾
(3)將過濾好的粗萃取液放到冰中並且蓋上蓋子避光
(4)取一比色管放入加入葉綠體濾液用0.5M蔗糖溶液稀釋到吸光值約為0.4~0.6
(5)加入100μL DCMU 再加入100μL DCIP混合均勻
(6)測量A590此為zero time control
(7)用手電筒從上方貼附cuvette照射 ， 每30 sec記錄一次A590 (記錄時要蓋上光譜儀的蓋子)， 記錄至
2 min為止
伍、實驗結果
一.用紅墨水測不同波長燈卡的吸光值
分光光度計測量之吸收光譜
二.繪製standard curve
波長=515nm時
波長=515nm時
散佈圖
波長為515nm時的R² =0.9968
波長為470nm時的R² =0.9881
由圖可知:稀釋倍率越小，代表墨水濃度越低，吸光值也越低
三.葉綠體光反應實驗
1. 在黑暗條件下測量吸光值
2.在照光條件下測量吸光值
3. 在照光條件下測量吸光值且在加入DCIP前有加入DCMU
陸、實驗紀錄與檢討
粗萃取的葉綠素
在上課開頭，老師提到生物是跨領域的應用，能藉由偵測光電訊號的變化來量測生命現象，讓我感到相當新鮮。這次其中一個實驗是利用紅莧菜葉綠體加入 DCMU（光合作用抑制劑）與 DCIP，理論上吸光值 A_{590} 應保持穩定不變。
然而，我們的結果卻呈現「先降後升」。經排查，初期下降可能是 DCMU 未完全混勻，導致少數 DCIP 短暫被還原；後期回升則可能是粗萃取液的雜質沉降增加光散射，或是還原態 DCIP 接觸氧氣被重新氧化。雖然結果與理論有出入，但透過分析這些干擾因素，反而讓我對光合作用與光學檢測有了更深層的理解。
柒、參考資料來源
https://zh.wikipedia.org/zh-tw/比尔-朗伯定律
https://zh.wikipedia.org/zh-tw/二氯苯基二甲脲
https://zh.wikipedia.org/zh-tw/2,6-二氯靛酚
https://reurl.cc/jV5ALp
Page updated
Google Sites
Report abuse