這堂課的內容主要可以分為「微生物簡介」和「微生物染色」兩大部分。

本次實驗為細菌「簡單染色」與「格蘭氏染色」之練習。 

一、菌種

• E.Coli 大腸桿菌（Escherichia coli） 

• B.subtilis 枯草桿菌（Bacillus subtilis）

二、器材

• 簡單染色染劑(結晶紫)

• 革蘭氏染色染劑(結晶紫、碘液、番紅)

• 複式顯微鏡(油鏡)

• 蓋玻片

• 載玻片

• 95%酒精

• 鏡油

• 無菌水

• 洗瓶

一、Simple staining 簡單染色法

此染色法為只使用一種染劑對菌體做染色處理。由於細菌細胞壁及核酸部分成分帶負電，使用帶正電荷之染色劑，如結晶紫、龍膽紫、甲烯藍等，能使染劑吸引並結合至菌體上，使細菌成色使用結晶紫大約20-60秒。

二、Gram's staining 革蘭氏染色法

此染色法由丹麥醫師 Hans Christian Gram 於1884年發明，透過細菌細胞壁成分的不同，初步辨識細菌。

流程可概括為：染色-媒染-脫色-複染。

• 第一步：初染劑（Primary Stain）

使用結晶紫染色，染色部位主要為染細胞壁上的肽聚醣。

• 第二步：媒染劑（Mordant）

加入革蘭氏碘液後，兩者會形成不溶性的結晶紫-碘（CV-I）複合體。細菌呈紫黑色。第二步是關鍵，它的目的是分辨細菌的革蘭氏染色特性。若為革蘭氏陽性菌，此複合體結合於細胞壁之鎂、核糖核酸，形成鎂-核糖核酸-結晶紫-碘（Mg-RNA-CV-I）複合體，不易脫去，染劑固定。

• 第三步：脫色劑（Decoloring Agent）

使用酒精（95%）脫色。此步驟對革蘭氏陽性細菌無效，因為其細胞壁上厚厚的細胞壁層次多，交聯緻密，故遇脫水時網孔縮小，再加上不含類脂，使得乙醇不會溶出縫隙，因此阻隔了結晶紫-碘複合體的外滲，仍然呈紫色只能留在細菌體內。革蘭氏陰性菌細胞壁層薄，外膜類脂含量高、肽聚醣層薄和交聯度差，在遇脫色劑時，以類脂爲主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚醣網不能阻擋複合體溶出，因此會被脫色而成為無色。

• 第四步：複染劑（Counterstain）

為了對比，在此之後會加入番紅進行複染，革蘭氏陰性菌成紅色，而革蘭氏陽性菌仍保有原來的紫色。

• 革蘭氏陽性菌：細胞壁肽聚糖層較厚，染劑易留於菌體內而呈藍紫色

• 革蘭氏陰性菌：細胞壁肽聚糖層較薄，染劑不易留於菌體內而呈紅色

• Simple staining 簡單染色法

1. 使用熱固定法製作細菌抹片

2. 將結晶紫停留在細菌上40秒

3. 使用二次水沖洗多餘染劑

4. 用擦手紙擦拭玻片(注意勿擦拭到菌體)

5. 蓋上蓋玻片後使用顯微鏡觀察，100X鏡頭需使用鏡油觀察

• Gram's staining 革蘭氏染色法

1. 使用熱固定法製作細菌抹片

2. 初染－結晶紫，10秒後用二次水清洗，擦手紙擦乾

3. 媒染－碘液，10秒後用二次水清洗

4. 去色－95%酒精，洗至沒有染劑顏色流出，10秒後用二次水清洗

5. 回染－番紅，10秒後用二次水清洗

6. 蓋上蓋玻片後使用顯微鏡觀察，100X鏡頭需使用鏡油觀察

圖一、E.coli (簡單染色法)

圖二、B.subtilis (革蘭氏染色法)

圖三、E.coli (革蘭氏染色法)

由圖二與圖三的結果可知，B.subtilis 為革蘭氏陽性菌；E.coli 為革蘭氏陰性菌。

在本次實驗的過程中，我們利用油鏡觀察兩種染色方式的大腸桿菌。因為第一次做這個實驗，我們第一次嘗試所有細菌都變成紅色，後來檢查實驗流程發現是脫色太久，改正後第二次重做就正常了。