Modulo 3

• apri una finestra di browser sulla pagina principale di GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)

• digita GSE14834 nella barra di ricerca

• scorri lentamente la pagina di visualizzazione della Serie GEO GSE14834. Prendi il tempo necessario per esplorare le diverse sezioni che compongono la pagina (informazioni generali, piattaforme, campioni, download dei dati).

• Segui i link alle piattaforme elencate, segui il link relativo a uno o due campioni nella serie di dati: nota ad esempio il diverso contenuto della pagina dei dettagli del campione rispetto alla pagina dei dettagli della piattaforma.

• Rispondi alle seguenti domande:

1. Qual è la differenza tra gli identificatori di campioni, piattaforma e serie? Qual è il loro rapporto?

2. Qual è la relazione tra la tabella visualizzata nella pagina dei dettagli di GPL570 e quella visualizzata nella pagina dei dettagli del campione GSM371757, della serie di dati GSE14834?

3. Che tipo di dati sono inclusi nella serie di dati GSE14834?

• raggiungi la sezione di download dei dati in fondo alla pagina di visualizzazione del dataset GSE14834 (è la sezione denominata "Download family"). Si noti che la stessa serie di dati è disponibile in più formati per il download.

• tra i formati di dati disponibili, scegli "Series Matrix File(s)".

• dalla pagina di download che si aprirà, copia il link per scaricare il file compresso "GSE14834-GPL8191_series_matrix.txt.gz". Quale formato di file ti aspetti? Su che basi la tua ipotesi?

• apri una finestra di terminale bash sul computer

• crea una cartella sul tuo PC (dove vuoi tu) chiamata "tutorial_geo_gse14834"

• scarica il file "GSE14834-GPL8191_series_matrix.txt.gz" (prova a scaricarlo dalla riga di comando bash utilizzando il comando wget [utenti Ubuntu] o il comando curl [utenti MAC OS]. In alternativa, è possibile scaricare manualmente il file dalla pagina web e salvarlo dove si desidera).

• sposta la cartella compressa appena scaricata nella cartella chiamata "tutorial_geo_gse14834" che avevi appena creato (riesci a afarlo da terminale bash?)

• decomprimere il file dalla riga di comando. Quale comando bash utilizzerete per farlo?

• esplora il file dalla riga di comando utilizzando i comandi bash che abbiamo imparato finora (ls, wc, less, head, tail). Quanto pesa il file? Quante righe contiene? Quante righe vi sareste aspettati (e perché)? Come descrivereste il formato/contenuto del file?

• ora, provare a estrarre la tabella dei valori di espressione normalizzati che è inclusa nel file. Ecco un paio di vie alternative:

(1.) [Da riga di comando] uggerimento: dalla riga di comando, quando si utilizza il comando grep con l'opzione --line-number, si ottiene il numero di riga in cui si trova un determinato pattern. Provate ad esempio ad eseguire il seguente comando bash: 

grep --line-number "\!series_matrix_table_begin" GSE14834-GPL8191_series_matrix.txt

(2.) caricando il file in un foglio di calcolo

Il dataset GSE14834 è tra i dataset della banca dati GEO che supporta di condurre un'analisi differenziale online, senza necessità di conoscenze di programmazione, tramite l'interfaccia GEO2R.

Vediamo allora di rispondere a questa domanda utilizzando GEO2R. Per farlo, esegui i passaggi indicati qui sotto:

• Apri la pagina della banca dati GEO di NCBI relativa al dataset GSE14834

• Scorri la pagina fino a trovare il pulsante "Analyze with GEO2R", poi fai click su questo pulsante

• Nella nuova pagina che sia apre, troverai GSE14834 come valore preimpostato per il campo "GEO accession"

• Nel campo platform, seleziona dal menù a tendina il corretto valore per analizzare i dati di espressione genica ottenuti con la piattaforma Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array → comparirà una serie di righe che illustrano i campioni presenti in questo set di dati per la piattaforma selezionata

• Dal menù in alto, accanto alla voce Samples, fai click sulla voce "Define groups"

• Nel menù a tendina che si apre, crea due gruppi chiamati T-ALL e B-ALL (per creare un gruppo, scrivi il nome desiderato e premi invio)

• Una volta definiti i due gruppi, seleziona i campioni corrispondenti e poi fai click sul nome del gruppo cui appartengono. Esempio: seleziona (click e trascina il mouse) tutte le 4 righe dei campioni il cui nome (colonna Title) inizia con la parola T-ALL, poi seleziona la voce "T-ALL" dal menù dei gruppi appena definiti per attribuire i campioni selezionati a questo gruppo. 

• Ora ripeti la stessa operazione (selezione dei campioni e attribuzione al gruppo corretto) per i campioni di B-ALL

• Scorri la pagina fino in fondo, esplora il contenuto della voce"Options": qui vedi specificati i parametri adottati per l'analisi statistica che valuterà, per ogni gene, l'eventuale espressione differenziale.

• Ora torna sulla voce GEO2R e premi il pulsante Analyze →questo lancerà l'analisi di espressione differenziale (cioé a dire, per ogni probe della piattaforma Affymetrix considerata, verrà effettuato un t-test per stimare se i valori di espressione medi della data probe nel gruppo di campioni di T-ALL differisce significativamente o meno dalla media di espressione nel gruppo di campioni di B-ALL).

• Al termine del processamento dei dati, compariranno una serie di grafici (→diagnostici dei campioni analizzati e riassuntivi dei risultati dell'analisi di espressione differenziale) insieme ad una tabella di dettaglio dei risultati del t-test.

• Tra i plot generati, il venn diagramm riassume il numero di probes (→ geni) che sono risultati differenzialmente espressi nell'analisi fatta (cioé, che hanno ottenunto nel t-test un p-value - sia grezzo che aggiustato per test multipli - minori della soglia fissata per determinare i risultati significativi: p-value aggiustato <- 0.05). → Quante sono le probes differenzialmente espresse tra T-ALL e B-ALL?

• Scarica la lista dei risultati del test relativa alle probes differenzialmente espresse. Per farlo: 

  • 1. torna sul plot Venn Diagram

    2. premi il tasto: Explore and Download

    3. seleziona il confronto tra campioni per cui si vogliono scaricare i risultati (qui ne abbiamo solo uno: T-ALL vs B-ALL)

    4. infine, premi il tasto "Download significant genes"→verrà salvato sul tuo PC un file di testo separato da tabulazioni

• Apri il file appena scaricato in un foglio di calcolo, poi prova a rispondere alle seguenti domande:

Che relazione c'è tra geni e probes? 

Tutte le probes corrispondono ad un gene umano? 

Quante colonne contiene questa tabella dei risultati? Sapresti descrivere / ti è chiaro il contenuto di tutte le colonne?

• Usa ora la voce "Prophile graph" dal menù principale dell'analisi per generare un barplot dei valori di espressione della probe risultata più significativa all'analisi di espressione differenziale. GUardando il plot generato, prova a rispondere alle seguenti domande:

Perché questa probe è risultata differenzialmente espressa?

Questa probe risulta up- o down-regolata in pazienti di B-ALL rispetto ai pazienti di T-ALL?

• Infine, dai uno sguardo al contenuto della voce del menù "R script": qui trovi la collezione di comandi testuali (script), scritti nel linguaggio di programmazione R, che esegue in modalità testuale la stessa analisi da te fatta in modalità grafica ed interattiva. Potresti, volendo, scaricare ed eseguire sul tuo PC, da un terminale R, la stessa analisi. 

ti viene in mente un vantaggio dell'esecuzione dell'analisi in modalità grafica ed interattiva rispetto alla modalità testuale (da terminale R)?

ti viene in mente un vantaggio dell'esecuzione dell'analisi in modalità testuale (da terminale R) rispetto alla modalità grafica ed interattiva rispetto?

Per rispondere a questa domanda, adatta opportunamente le istruzioni che hai già seguito al punto (3) dell'attività intitolata "TARGET VALIDATI del miRNA hsa-miR-122" del Modulo 1