Embedded Files
Microscopía de Fluorescencia
Microscopía de Fluorescencia
Técnica que permite observar y localizar estructuras sub-micrométricas con un máximo de versatilidad y un mínimo de daño irreversible a la muestra. La capacidad de marcar independientemente diferentes partes de una célula con anticuerpos o sondas sintéticas y luego visualizar los marcadores con una alta relación señal-ruido ha permitido a biólogos y bioquímicos estudiar procesos intracelulares con un nivel de detalle sin precedentes.(1)
La Fluorescencia es la capacidad de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en otra longitud de onda diferente, puede ser visible debido a las siguientes moléculas:
· Fluorocromos: moléculas capaces de absorber fotones y emitir fotones de menor energía (mayor longitud de onda);
Fluoróforos: parte del fluorocromo responsable de la emisión de fluorescencia (2)
Moléculas fluorescentes específicas también pueden inyectarse en un animal o directamente en las células y se utilizan como marcadores. Tales métodos han sido útiles en el estudio de uniones intercelulares (del tipo de los nexos), en la localización del trayecto de fibras nerviosas en neurobiología y en la detección de marcadores fluorescentes del crecimiento de los tejidos mineralizados.
Entre la fuente de luz UV y la muestra se insertan varios filtros para producir luz monocromática o cuasimonocromática (de una sola longitud de onda o de longitud de onda de banda estrecha). Un segundo conjunto de filtros colocados entre la muestra y el objetivo permite que solo la estrecha banda de longitud de onda de la fluorescencia llegue al ojo, a una emulsión fotográfica o a otro procesador analítico.
Disminución de Fluoroscencia
Disminución de Fluoroscencia
1. Photobleaching (Fotoblanqueo): Descomposición irreversible de las moléculas de los fluorocromos. Relacionado con la intensidad y tiempo de excitación de la muestra.
2. Quenching (enfriamiento): Cualquier proceso que disminuye el tiempo del estado excitado o el tiempo de vida de un fluorocromo.
Imágenes
Imágenes
Ventajas
Ventajas
Alto contraste
Alta especificidad
Cuantitativa
Imágenes in vivo
Se pueden obtener resultados rápidos
No es necesario realizar cultivos
Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto
Determina la identidad de un organismo muerto
Sensible
Desventajas
Desventajas
Rápido fotoblanqueo
Alta dispersión de la luz
Imágenes 2D
Baja resolución
Autofluorescencia
Costos en reactivo y equipo
Debe ser realizado por personal muy especializado
Los resultados no son 100% específicos
Aplicaciones
Aplicaciones
Técnicas analíticas (cuali y cuantitativas) en Química y Bioquímica.
Métodos inmunológicos de diagnóstico médico.
Procedimientos microscópicos en Microbiología, Genética, Histología, Histoquímica, Biología Celular, Biología Molecular, Biología del Desarrollo, Patología (sondas vitales, ensayos de viabilidad, indicadores, inmunofluorescencia, FISH).
Análisis poblacional de células (citofluorimetría de flujo).
Parámetros de Fluorescencia
Parámetros de Fluorescencia
· Afinidad
· Selectividad
· Especificidad
· Intensidad (brillo)
· Estabilidad
· Competitividad
Pasos para Detección de Anticuerpos Anti-Cándidas por Inmunofluorescencia
1. Colocar 10 μl de una suspensión de 106 cándidas en cada pozos de un portaobjeto de 7 pozos. Dejar secar.
2. Agregar 20μl de suero diluído 1/16- 1/32- 1/ 64- 1/128- 1/256- 1/512- negativo en cada pozos. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda.
3. Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes.
4. Agregar 20ul de suero anti Fc- FITC (dilución 1/100). Incubar 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad en cámara húmeda.
5. Lavar 5 minutos con PBS. (Repetir 2 veces). Secar los bordes.
6. Montar con 1 gota de glicerina bufferada.
7. Observar en microscopio de Inmunofluorescencia. La imagen es positiva si permite ver fluorescente el contorno de la levadura.
Ejemplo de visualización de una célula en mitosis a través de microscopio de fluorescencia
Comparación
Comparación
Visita la página de Microscopio Confocal para conocer más acerca de él
Visita la página de Microscopio Confocal para conocer más acerca de él
Bibliografía:
1. Doctoral T. Tesis Doctoral Diheteroariletenos fluorescentes como sondas para microscopía de fluorescencia Diheteroariletenos fluorescentes como sondas para microscopía de fluorescencia. 2016.
2. Principles Of Instrumental Analysis F. James Holler, Douglas A. Skoog & Stanley R. Crouch 2006
3. Hackler AL, et al. Off-DNA DNA-Encoded Library Affinity Screening. ACS Comb Sci. 2020.
4. Weng L, et al. Droplet Microfluidics-Enabled High-Throughput Screening for Protein Engineering. Micromachines (Basel). 2019.
5. Gao Z, et al. A Facile Strategy for Visualizing and Modulating Droplet-Based Microfluidics. Micromachines (Basel). 2019
Report abuse