Microscopio Confocal

La microscopia confocal (CLSM o LSCM) es una técnica que ha llegado a desarrollarse completamente desde finales de los años 80s. Sin embargo, su fundamento teórico sobre el que descansa, fue pronunciado por Marvin Minsky en 1953 cuando éste cursaba una estancia postdoctoral en la Universidad de Harvard. Invención que patentó en 1957. Es un método no invasivo de imágenes ópticas que puede proporcionar imágenes microscópicas de tejido no tratado que se corresponden casi perfectamente con los portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina.

En el microscopio convencional colocamos una sección de tejido en la platina y se visualiza y se ilumina todo el campo de la muestra al mismo tiempo. A pesar de que la intensidad más brillante y alta se encuentra en el punto focal del lente, nos puede provocar cierto “ruido” de fondo que compromete la calidad de la imagen. En la microscopia confocal, un haz de luz entrante (el haz de excitación) se enfoca a través del objetivo del microscopio en un pequeño punto dentro del tejido.

Este objetivo reúne la luz reflejada que regresa del tejido, pero a diferencia del microscopio convencional la luz se proyecta y no se ve directo.

La luz de excitación en la microscopía confocal de fluorescencia generalmente es provista por un láser a una longitud de onda que también excitará un fluoróforo específico.

En algunos casos, se puede usar más de un fluoróforo al mismo tiempo, y cambiando la luz de excitación u observando a diferentes longitudes de onda de emisión, se pueden distinguir diferentes partes de la muestra. Cuando el láser de excitación golpea el tejido objetivo, genera altas intensidades de fluorescencia en un punto focal bien definido. Tanto la luz láser (el haz de excitación) como la emisión de fluorescencia resultante pasan a través del mismo objetivo: un espejo especial llamado espejo dicroico que refleja la luz láser entrante de mayor energía (pero menor longitud de onda), pero permite la entrada de menor energía. (fluorescencia de mayor longitud de onda) para pasar a través del detector de luz.

Componentes

1) Láser, como fuente luminosa temporal, que focaliza el haz de luz en un solo punto de la muestra, de modo que barre la muestra plano a plano, creando multitud de imágenes bidimensionales que un ordenador interpreta, generando finalmente una imagen tridimensional del objeto a estudio.

2) Diafragmas que limitan la accesibilidad del haz. Se encuentran situados antes y después de la lente, permitiendo enfocar la iluminación en un único punto.

•Un diafragma de iluminación localizado tras la fuente luminosa denominado "pinhole de excitación", cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen.

• Un diafragma de detección, de tamaño variable situado entre la lente y el fotodetector, denominado "pinhole de emisión".

3) Software que permite mejorar la calidad de la imagen por disminución de la sensibilidad de los fotodetectores a intensidades bajas de fluorescencia, con lo que se reduce el ruido de fondo.

Algunos factores, como la apertura variable del pinhole, la precisión, número y velocidad del barrido pueden influir en la obtención de una buena imagen.

Caminos ópticos en un microscopio confocal invertido

Fuentes de luz

Lámpara de luz visible stándard de cualquier microscopio que nos permite localizar muestras en campo claro o contraste de fases.
Lámpara de vapor de mercurio. Se suele usar para observar las muestras y localizar aquellas zonas de interes para ser escaneadas en condiciones de confocalidad.
Láser. El más empleado es el de argón-kriptón que da tres líneas de salida. Es posible montar simultáneamente varias fuentes láser. En las instalaciones donde existe más de un láser, el segundo suele ser uno que emite en el ultravioleta.

Microfotografía de área desmineralizada bajo microscopía confocal

Microfotografía de área remineralizada bajo microscopía confocal

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Reconstrucción in situ de formación de biofilm en la parte interna de un implante

A, B y C, muestran reconstrucciones en 3D de superficies mecanizadas, granalladas y tratadas con láser, respectivamente. Se puede observar una cobertura completa de las partes internas de los hilos del implante con células en su mayoría viables en todas las muestras, excepto en las superficies tratadas con láser. Las reconstrucciones D (espécimen granallado) y E (espécimen tratado con láser) muestran con mayor aumento la parte interna de un hilo de implante. Las muestras tratadas con láser presentan pocas células microbianas muertas que colonizan el fondo de los hilos, mientras que se puede encontrar una colonización intensa de células predominantemente viables en las superficies inclinadas de los hilos.

Usos e Indicaciones

En la práctica clínica hasta la fecha, la microscopía confocal se ha utilizado con el objetivo de evitar la necesidad de biopsias por escisión, reduciendo así la necesidad de un examen patológico.

Gracias a éste herramienta ha sido posible resolver con éxito problemas biológicos hasta el momento impracticables, como pueden, por ejemplo algunos de los siguientes:

a) Realizar reconstrucciones efectivas en 3-D (X,Y,Z)partiendo de una pila de secciones ópticas y poder analizar la información espacial y volumétrica de las muestras a estudio.

b) Generar fácilmente imágenes con múltiples sondas marcadas con fluorocromos distintos, siguiendo los procedimientos habituales de inmunofluorescencia. Realizar ensayos de colocalización cuantitativa. Detectar la coincidencia de dos moléculas marcadas con dos fluorcromos distintos y poder investigar sus relaciones de proximidad e interacción. La imágenes obtenidas pueden ser analizadas estableciendo los correspondientes coeficientes de colocalización.

c) La posibilidad de hacer estudios in vivo sobre cultivos celulares o tisulares y poder monitorizar distintas variables (concentraciones iónicas, pH etc) siguiendo una serie temporal. Adquisición y visualización de series temporales (X,Y,t o X,Y,Z,t).

d) Investigar la interacción molecular mediante la transferencia de energía entre una molécula donante marcada con un fluorocromo y una molécula aceptora que se encuentre a una distancia entre 1 a 10 nm. (FRET Flores-cence Resonance Energy Transfer).

e) Poder hacer estudios de emisión espectral (adquisición de pilas lambda) y poder caracterizar éstos espectros al compararlos con espectros de referencia lo que posibilitaría identificar algunas moléculas determinadas que presenten propiedades de autoflorescencia y que estén presentes en los tejidos.

f) Y finalmente, poder realizar estudios microscópicos de FLIP y FRAP (Fluorescence Loss in)

Neuronas corticales

Retina y nervio óptico

Músculo

Preparación de la Muestra

La preparación de las muestras varia según los procedimientos y las estructuras que se deseen visualizar. Por ejemplo: Células HeLa se tienen en medio de cultivo y son fijadas con glutaraldehido y PBS (solución buffer de fosfatos) y MgSO4. Luego son lavadas con PBS y tratadas con boro hídrico, Triton X-100 en PBS. Se colocan luego los anticuerpos monoclonales de antitubulina y FITC y finalmente son montadas en glicerol, para ser observadas al microscopio confocal observando imágenes nítidas y detalladas de los microtubulos. Los huevos de Psammechinus miliaris fertilizados son colocados en glicerol al 40% y son colocados en laminas cubiertas con poli-L-lisina, luego fijadas con metanol y tratadas con anticuerpos antitubulina que diferencia los centros mitoticos periféricos. Las células de una línea celular de plasmacitoma son fijadas al 3.5% de formaldehído permeabilizado con saponina y tratado con anticuerpos purificados contra endoplasmina. Las glándulas salivares de Drosopila; se realiza disección de la larva y se colocan en buffer A y cromomicina A3 que es un fluorocromo especifico del DNA así se observa el núcleo. Los embriones de nematodos se colocan en láminas recubiertas con poli-L-lisina congeladas en hielo seco, fijados con metanol y luego tratados con anticuerpos antitubulina y FITC.

Depende de los procedimientos y las estructuras que se deseen visualizar. Sin embargo, la preparación de las muestras es igual a la utilizada para microscopía de fluorescencia convencional y/o citometría de flujo, en cuanto a los métodos de fijación y la tinción o marcaje.

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Comparación

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