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Microscopio óptico
Microscopio óptico
Conceptos básicos
Conceptos básicos
El vocablo griego "microscopio" proviene de "micrós" que significa pequeño y "scopéo" que significa mirar, por lo que es un instrumento que nos permite observar cosas de tamaño tan pequeño que de otra manera seria imposible para el ojo humano. El microscopio ha marcado un antes y un después en la historia de la ciencia, especialmente en el campo de la biología y de la medicina.
El microscopio óptico esta basado en lentes ópticas, se le conoce también como "de luz" ya que utiliza fotones, o microscopio de campo claro. Los microscopios antiguos constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar. Este uso de una única lente convexa se conoce como microscopio simple en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.
En un microscopio óptico podemos distinguir entre el sistema óptico y el sistema mecánico.
El sistema óptico incluye el conjunto de lentes y elementos de manipulación de la luz necesarios para generar una imagen aumentada.
El sistema mecánico proporciona el soporte estructural a los anteriores elementos.
Microscopio óptico
Microscopio óptico
Historia
Historia
Griegos y romanos: Ya los antiguos sabían que los espejos curvos y las esferas de cristal llenas de agua aumentaban el tamaño de las imágenes. (1461-1492).
En las primeras décadas del siglo XVII se iniciaron experiencias con lentes (así llamadas por tener forma de lentejas) a fin de lograr el mayor aumento posible. Para ello se basaron en otro instrumento con lentes que obtuvo gran éxito, el telescopio, usado por primera vez con fines astronómicos por Galileo, en 1609.
Jan Swammerdam
Existían dos tipos de microscopios, el sencillo y el compuesto; el sencillo no era más que una lente montada, el compuesto estaba formado por una combinación de lentes y fue inventado por Zacharias Jansen en Holanda.
Microscopio simple: el empleo de lentes montados para observar lo mas pequeño que existía eran los mosquitos o los insectos diminutos.
Tubo metálico empleando dos lentes en los extremos. Permitiendo observar formas y estructuras que eran desconocidas.
•El naturalista holandés Jan Swammerdam observó insectos con el microscopio haciendo incapié en su conformación, descubrió también que la sangre no es un líquido uniforme rojo sino que existen corpúsculos que le dan ese color.
•El botánico inglés Nehemiah Grew estudió los órganos de reproducción de las plantas y descubrió los granos de polen.
•El anatomista holandés Reigner de Graaf realizó estudios similares en animales describiendo ciertos elementos del ovario que desde entonces se conocen con el nombre de folículos de Graaf.
•Microscopio simple: esta provisto de una lente o sistema de lentes convergentes dispuestas de manera que proporcionan una imagen virtual, derecha y mayor que el objeto, que a la vez esta situado entre el lente y el foco. La ampliación del microscopio simple es bastante limitada y suele utilizarse para la disección de pequeños animales o para disociación de piezas histológicas.
•Este tipo de microscopio se denomina también lupa. Las lupas pueden ser monoculares o binoculares.
•Microscopio compuesto:
Combinan dos lentes o sistemas de lentes convergentes de amplificación de imagen, colocados en los extremos del tubo: el denominado objetivo, situado mas cerca del objeto a observar, y el el ocular, mas cercano al ojo del observador.
Marcello Malpighi: Sus primeros estudios los realizó con pulmones de rana, pudiendo observar en ellos una compleja red de vasos sanguíneos, demasiado pequeños para ser vistos por separado y muy anastomosados. Cuando siguió el recorrido de los vasos hasta que se unían con otros mayores, comprobó que estos últimos eran venas en una dirección y arterias en dirección opuesta. Por consiguiente, las arterias y las venas se hallaban unidos mediante una red de vasos llamados capilares.
Modelos de microscopios Italianos del siglo XVII como los que utilizó Marcello Malpighi
•Robert Hooke: En 1665 publicó un libro llamado Micrographia en el cual pueden encontrarse algunos de los mejores dibujos que se hallan hecho de observaciones microscópicas.
Microscopio utilizado por Hooke
•Anton van Leeuwenhoek usaba lentes simples, que por su reducido tamaño podían obtenerse de pequeños trozos de cristal perfecto. Puliendo cuidadosamente dichos fragmentos, logró aumentar un objeto hasta 270 veces sin perjuicio de la nitidez. Tenía 419 lentes alguna de las cuales eran de cristal de roca y hasta de diamante, en algunos casos no eran mayores que el tamaño de un alfiler, por lo que sus microscopios tenían un tamaño diminuto comparados con otros de la misma época.
•Con esas lentes observaba todo lo que podía y logró describir los glóbulos rojos de la sangre y los capilares con mayor detalle.
•Descubrimiento de pequeños organismos invisibles a simple vista, al estudiar aguas estancadas con su microscopio: “animalículos”, como los denominó entonces, conocidos hoy como protozoarios que en griego significa pequeños animales.
•El microscopista danés Otto Muller consiguió en 1773 distinguir lo suficientemente bien a aquellos pequeños seres para clasificarlos en dos tipos: bacilos (que significa “pequeños vástagos”) y espirilos (por su forma espiral).
•Uno de los defectos de los microscopios primitivos era que sus lentes descomponían la luz blanca en los colores que la constituyen. Pero alrededor de 1820 se perfeccionaron cuando Joseph Jackson Lister, un óptico inglés, diseñó un microscopio acromático capaz de eliminar los anillos de color que limitaban la claridad de la imagen. El microscopio acromático constituyó un gran avance, iniciando una serie de perfeccionamientos que dieron como resultado el moderno microscopio óptico.
•Desde 1660 hasta la actualidad el microscopio óptico ha sido el pilar fundamental en el conocimiento de lo invisible. Aunque su poder de resolución aumentó a través del tiempo (con la mejora en la calidad de las lentes) al igual que el poder de magnificación, su factor limitante fue la longitud de onda de la luz. En 1930 el mundo submicroscópico se amplió con la aparición del microscopio electrónico cuya ventaja principal con respecto al microscopio óptico es un aumento de 1000 veces en la magnificación del material observado acompañado de una mayor capacidad de resolución generando una mejor definición y una ampliación del mundo microscópico. ADN, virus y pequeñas organelas fueron observadas por primera vez con este microscopio.
•La mayoría de los pioneros en la microscopía electrónica en biología siguen vivos y los más importantes son: Albert Claude, Don Fawcett, Earnest Fullam, Charles Leblond, John Luft, George Palade, Daniel Pease y Keith Porter. Claude y Palade recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1974 por sus logros en biología celular utilizando el microscopio electrónico.
Funcionamiento del microscopio óptico
Funcionamiento del microscopio óptico
“Un microscopio funciona de forma muy parecida a la refracción de un telescopio, pero con algunas diferencias.”
“Un microscopio funciona de forma muy parecida a la refracción de un telescopio, pero con algunas diferencias.”
Un telescopio debe reunir grandes cantidades de luz de un objeto distante y tenue; por eso, necesita de grandes objetivos para reunir tanta luz como sea posible y traerla hacia el foco. Debido a que el objetivo es grande, aporta una imagen nítida del objeto distante, por esto los telescopios son mucho más grandes que los microscopios. El ocular del telescopio magnifica esa imagen y se la aporta a tu ojo.
En contraste con el telescopio, un microscopio debe recoger la luz de una pequeña área de una fina muestra, de esta forma se iluminará bien al espécimen. Por lo que el microscopio no necesita objetivos grandes. En lugar de eso, el objetivo del microscopio es pequeño y esférico, lo que significa que tiene una longitud focal más corta, a cada lado. Esto aporta la imagen del objeto que se encuentra en el foco a un distancia corta dentro del tubo del microscopio. La imagen se magnifica por una segunda lente llamada lente ocular cuando se pone en tu ojo.
“La otra diferencia principal entre el telescopio y el microscopio es que un microscopio tiene una fuente de luz y un condensador. El condensador tiene un sistema de lentes que focaliza la luz de la fuente hacia el pequeño punto del espécimen, la misma área que el objetivo examina.”
“La otra diferencia principal entre el telescopio y el microscopio es que un microscopio tiene una fuente de luz y un condensador. El condensador tiene un sistema de lentes que focaliza la luz de la fuente hacia el pequeño punto del espécimen, la misma área que el objetivo examina.”
El principio de funcionamiento de un microscopio óptico se basa en la propiedad de algunos materiales que permiten cambiar la dirección de los rayos de luz. Esto permite fabricar lentes capaces de hacer converger o divergir los rayos de luz. Mediante la combinación de estas lentes se puede generar una imagen aumentada de cualquier objeto.
El principio de funcionamiento de un microscopio óptico se basa en la propiedad de algunos materiales que permiten cambiar la dirección de los rayos de luz. Esto permite fabricar lentes capaces de hacer converger o divergir los rayos de luz. Mediante la combinación de estas lentes se puede generar una imagen aumentada de cualquier objeto.
En el caso de un microscopio óptico se genera la imagen aumentada a partir de distintas lentes. Algunas de ellas montadas en el objetivo del microscopio y otras en el ocular. En primer lugar las lentes del objetivo generan una imagen real aumentada de la muestra. Esta imagen real es a continuación ampliada mediante las lentes del ocular dando lugar a una imagen virtual de tamaño superior a la muestra original.
En el caso de un microscopio óptico se genera la imagen aumentada a partir de distintas lentes. Algunas de ellas montadas en el objetivo del microscopio y otras en el ocular. En primer lugar las lentes del objetivo generan una imagen real aumentada de la muestra. Esta imagen real es a continuación ampliada mediante las lentes del ocular dando lugar a una imagen virtual de tamaño superior a la muestra original.
En los siguientes vídeos podemos aprender mas acerca del funcionamiento del microscopio
En los siguientes vídeos podemos aprender mas acerca del funcionamiento del microscopio
Componentes del microscopio óptico
Componentes del microscopio óptico
Las partes de un microscopio se pueden clasificar entre las que pertenecen a su sistema mecánico y las que pertenecen a su sistema óptico.
Las partes de un microscopio se pueden clasificar entre las que pertenecen a su sistema mecánico y las que pertenecen a su sistema óptico.
Sistema mecánico
Sistema mecánico
Elementos estructurales que dan estabilidad al microscopio y mantienen los elementos ópticos correctamente alineados.
Base o pie: Es la pieza que se encuentra en la parte inferior del microscopio y sobre la cual se montan el resto de elementos.
Brazo: El brazo constituye el esqueleto del microscopio. Es la pieza intermedia del microscopio que conecta todas sus partes. Principalmente conecta la superficie donde se coloca la muestra con el ocular por donde ésta se puede observar. Tanto las lentes del objetivo como del ocular se encuentran también conectadas al brazo del telescopio.
Platina: Esta es la superficie donde se coloca la muestra que se quiere observar. Su posición vertical con respecto a las lentes del objetivo se puede regular mediante dos tornillos para generar una imagen enfocada. La platina tiene un agujero en el centro a través del cual se ilumina la muestra. Generalmente hay dos pinzas unidas a la platina que permiten mantener la muestra en posición fija.
Pinzas: Las pinzas tienen la función de mantener fija la preparación una vez esta se ha colocado sobre la platina.
Tornillo macrométrico: Este tornillo permite ajustar la posición vertical de la muestra respecto el objetivo de forma rápida.
Tornillo micrométrico: El tornillo micrométrico se utiliza para conseguir un enfoque más preciso de la muestra. Mediante este tornillo se ajusta de forma lenta y con gran precisión el desplazamiento vertical de la platina.
Revólver: El revólver es una pieza giratoria donde se montan los objetivos. Habitualmente el revólver permite escoger entre tres o cuatro objetivos distintos.
Tubo: El tubo es una pieza estructural unida al brazo del telescopio que conecta el ocular con los objetivos. Es un elemento esencial para mantener una correcta alineación entre los elementos ópticos.
Sistema óptico
Sistema óptico
Elementos necesarios para generar y desviar la luz en las direcciones necesarias y así acabar generando una imagen aumentada de la muestra.
Foco o fuente de luz: Este es un elemento esencial que genera un haz de luz dirigido hacia la muestra. La posición del foco en el microscopio depende de si se trata de un microscopio de luz transmitida o de luz reflejada.
Condensador: El condensador es el elemento encargado de concentrar los rayos de luz provenientes del foco a la muestra. En general, los rayos de luz provenientes del foco son divergentes. El condensador consiste en un seguido de lentes que cambian la dirección de estos rayos de modo que pasen a ser paralelos o incluso convergentes.
Diafragma: El diafragma es un pieza que permite regular la cantidad de luz incidente a la muestra. Normalmente se encuentra situado justo debajo la platina. Regulando la luz incidente es posible variar el contraste con el que se observa la muestra.
Objetivo: El objetivo es el conjunto de lentes que se encuentran más cerca de la muestra y que producen la primera etapa de aumento. En los microscopios modernos distintos objetivos están montados en el revólver. Este permite seleccionar el objetivo adecuado para el aumento deseado.
Ocular: Este es el elemento óptico que proporciona la segunda etapa de ampliación de imagen. El ocular amplia la imagen que ha sido previamente aumentada mediante el objetivo. En general, el aumento aportado por el ocular es inferior al del objetivo. Es a través del ocular que el usuario observa la muestra. En función del número de oculares se puede distinguir entre microscopios monoculares, binoculares e incluso trinoculares. La combinación de objetivo y ocular determina el aumento total del microscopio.
Prisma óptico: Algunos microscopios incluyen también prismas en su interior para corregir la dirección de la luz. Por ejemplo, esto es imprescindible en el caso de los microscopios binoculares, donde un prisma divide el haz de luz proveniente del objetivo para dirigirlo hacia dos oculares distintos.
¡Pondremos a prueba lo aprendido!. Da click en el siguiente botón para entrar a un sencillo juego.
¡No hagas trampa!
¡No hagas trampa!
Preparación de muestras para microscopio.
Preparación de muestras para microscopio.
Para el estudio de una muestra, es necesario llevar a cabo una preparación previa para poder observarla al microscopio.
Para el estudio de una muestra, es necesario llevar a cabo una preparación previa para poder observarla al microscopio.
1. FIJACIÓN.
1. FIJACIÓN.
Consiste en matar a la célula lo mas rápidamente posible para mantener las propiedades fisiológicas y morfológicas.
La fijación solidifica el coloide protoplasmático mediante coagulación y evita que el tejido se desintegre. 24 horas despues se continuará con el siguiente paso: Inclusión.
Físicos.
Físicos.
Calor (Húmedo o seco)
Frío (Congelación rápida)
Químicos.
Químicos.
Alcohol metílico.
Dicromato de potasio.
Erlinck.
Formol.
La muestra a ser fijada no debe tener mas de 3 mm de espesor ya que de esta forma el fijador no actuaría por igual en todas las células de la muestra.
El liquido debe exceder en 50:1 a la muestra. Debe ser un recipiente cerrado para evitar la volatilización. No exceder el tiempo de fijación y debe lavarse para quitar los excesos.
2. INCLUSIÓN.
2. INCLUSIÓN.
Para poder cortar la pieza, debe tener cierta consistencia. Para endurecerla , se incluye en un material que llegue a todas las estructuras celulares, el cual debe de ser una sustancia con plasticidad como la parafina, el colodión o la gelatina. Ésto permite conservar la muestra durante largo tiempo. Lo más común es utilizar la parafina por lo que se detalla el proceso de inclusión en ella:
A. Deshidratación.
A. Deshidratación.
Hacer pasar la muestra por una gradación creciente de alcoholes. Los tiempos dependen de si el proceso se realiza manualmente o automáticamente.
B. Aclaración.
B. Aclaración.
Se baña la pieza tres veces durante 30-40 minutos en un disolvente de parafina, como xilol, benzol o toluol.
C. Impregnación en parafina.
C. Impregnación en parafina.
Para evaporar el disolvente de la parafina y que ésta pueda penetrar en la pieza, se la incluye en parafina fundida.
D. Inclusión definitiva.
D. Inclusión definitiva.
La pieza se mete en parafina fundida depositada en moldes, normalmente en "cassettes" de parafina, para que al enfriarse podamos obtener bloques de parafina que incluyen la pieza.
3. CORTE.
3. CORTE.
La obtención de cortes para su estudio microscópico se realiza mediante unos aparatos llamados micrótomos.
Se pueden obtener diferentes grosores de cortes, hay cortes finos que son de 5-10 µm y semifinos de 0.5-5 µm.
Los cortes se colocan en vapor de agua a 45˚ con un 5% de gelatina y se toman con el portaobjetos.
Una vez obtenidos los cortes, se tiñen para evitar que se sequen.
4. TINCIÓN.
4. TINCIÓN.
Los cortes no deben de contener parafina para que pueda penetrar el colorante.
Si anteriormente se encontraban en parafina, se sumergen por 15 minutos en Xilol, luego se elimina el Xilol en alcohol al 90% y después en agua destilada. Una vez eliminada la parafina, se procede a la tinción.
Existen diferentes tipos de tinción según su origen:
Naturales.
Artificiales.
Según su naturaleza:
Ácido.
Básico.
Neutro.
Una vez teñidos los cortes se deshidratan en alcohol y después se aclaran con dos baños de Xilol.
5. MONTAJE.
5. MONTAJE.
Existen varios tipos de procedimiento, entre ellos:
De gota pendiente.
Extensión o Frotis.
Aplastamiento.
En dicho proceso se untan los extremos del cubreobjetos con vaselina, con esto permitimos que exista adherencia y no se seque la muestra cuando esta se observara por mas de una hora.
Extensión o Frotis
Extensión o Frotis
Se extiende la gota sobre el portaobjetos con la ayuda de otro portaobjetos, rápidamente para evitar que se coagule. el liquido una vez extendido se fija, colorea y monta de manera normal. Comúnmente utilizado en estudio de sangre y bacterias
Aplastamiento
Aplastamiento
Es considerada la técnica mas común. Los cortes se depositan en el portaobjetos, si no se quiere conservar la muestra se coloca directamente sin un medio de montaje, sin embargo esta se degradara a causa del calor del foco, por otro lado si se requiere conservar se utilizara un medio de montaje bueno (ph neutro, secado rápido).
Actualmente el medio de montaje mas común es el Eukitt o en su defecto el bálsamo de Canadá.
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