蛋白質電泳分析

指導教授：鄭惠春老師

SDS PAGE 電泳

實驗原理

帶負電的蛋白質在電場中向陰極移動(核酸也是!!)，分子量較大的移動速度較慢，離起跑線較近，移動距離較少，分子量較少的物質則相反，通常用來分離核酸或蛋白質，也可以用來進行蛋白質純度的測試。

本次實驗使用的SDS PAGE 電泳和平常分離核酸用的電泳最大的區別就是它具有兩層膠，分別為上膠和下膠：

(1)Stacking gel(上膠)：濃縮、聚焦。膠的pH值為6.9，因為此時不帶電，所以蛋白質的移動速度緩慢，可以使不同wells的蛋白質集中成一條線

(2)Running gel(下膠)：分離。膠的pH值爲8.8，此時膠體內帶電，蛋白質移動速度較快，故可以分離出不同分子量的蛋白質。

除此之外，還有一項重要的差異就是是否加入SDS。SDS為一種帶負電的界面活性劑，可破壞分子結構並使蛋白質分子無論原本的電性為何皆帶正電，陽極移動。

實驗材料(resolving gel)

H2O 4.5mL 

29% Acrylamide Mix 2.7mL

1.5 M Tris (pH 8.8) 2.5mL

10% SDS 100μL

1% TCE (2,2,2-Trichloroethanol) 100μL

10% Ammonium Persulfate (APS) 100μL

TEMED 6μL

實驗步驟(resolving gel)

(1)先用酒精噴瓶與拭鏡紙將短玻璃和厚玻璃擦拭乾淨

(2)使用洗瓶 ddH2O 測試膠台,用擦手紙把水吸乾，確認膠台不會漏水

(3)於離心管中將上述物質配置成resolving gel (下膠) 並只要加入7.2mL的量!

(4)依照順序加到TCE時先將混和溶液搖晃均勻，最後再加入APS和TEMED

(5)將7.2mL的running gel加入玻璃片之間，並緩慢加入2mL的壓膠酒精

(6)當running gel凝固後，將上層液體倒乾，並用擦手紙吸乾酒精(注意不要用破下膠)

實驗材料(stacking gel)

H2O 3.4mL 

29% Acrylamide Mix 830μL

1.5 M Tris (pH 6.9) 630μL

10% SDS 50μL

10% Ammonium Persulfate (APS) 50μL

TEMED 5μL

實驗步驟(stacking gel)

(1)於離心管中將上述物質配置成stacking gel(上膠) 並只要加入2mL的量!

(2)依照順序加到SDS時先將混和溶液搖晃均勻，最後再加入APS和TEMED

(3)將2mL的stacking gel加入玻璃片之間，並插入10wells尺梳,盡量不要有氣泡

(4)30-60分鐘室溫靜置直至膠體凝固

結果紀錄

結果討論

針對紫外線相機下的成果說明：

紫外線相機畫面中可見單一特性之蛋白質在膠體中所佔區域較大，拖測可能受到進行電泳時所施加的電壓相關。此次實驗中我們使用220伏特之電壓進行實驗。雖然高電壓將加快蛋白質電泳速度，然而會造成結果的解析力下降，如相機畫面中現象。而紫外線相機拍攝畫面下方可見白色線條則為電泳前端，將電泳時間拉長可將蛋白質區隔拉大並讓前端「跳海」。