分子遺傳學實驗

DAY 2   全日課程 

授課老師 :  黃貞祥 教授

• 台灣肉用鴨及蛋用鴨介紹

• 台灣肉用鴨與蛋用鴨之畜試及育成簡介

• PCR反應學習

• 分子遺傳標記

壹、實驗目的：

1. 學習利用聚合酶連鎖反應（PCR）、限制性片段長度多態性（RFLP）與凝膠電泳（Gel electrophoresis）進行分子遺傳標記。

貳、實驗原理：

PCR

PCR是Polymerase Chain Reaction（聚合酶連鎖反應）的簡寫，於1985年所發表，至今仍廣泛的運用在多種領域的研究上。其原理為重複複製特定的DNA片段，以達到大量擴增特定DNA序列的目的。PCR 可分為三個主要階段，第一階段為變性（Denaturation），將DNA模板加熱至高溫（本實驗採用98°C），破壞其氫鍵，使雙股DNA分開成兩條單股DNA。第二階段為退火（Annealing），降低溫度（本實驗採用55°C）， 使加入的DNA引子（primer）可以與原DNA形成鍵結。第三階段為延伸（Extension），升高溫度至DNA聚合酶之最適工作溫度（本實驗採用72°C），使DNA聚合酶以引子為起點，以模板DNA為參考，合成新的DNA鏈，完成複製。以上三個過程合併計為一個循環（cycle），每經過一次循環，DNA便會複製成兩倍，反覆進行多次循環，即可使DNA數目以指數級增長，達到大量複製的目的。

RFLP

RFLP是Restriction Fragment Length Polymorphism，於1984年由英國科學家Alec Jeffreys發明。其原理為利用限制性內切酶切割DNA，然後透過電泳分​​析不同長度的DNA片段來識別多態性，可用於基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。本實驗中由於北京鴨與土番鴨的基因會被所使用的限制酶切斷，番鴨則不會，便可利用凝膠電泳辨識其多態性。

凝膠電泳

凝膠電泳（Gel electrophoresis）是一種常用於分離DNA、RNA或蛋白質分子的方法。利用分子在電場中因大小與帶電性不同，而在凝膠中移動速率不同的特性，達到分離物質的目的。

CHD primer

鳥類的性染色體為ZZ（雄性）和ZW（雌性）。CHD基因同時存在於Z和W染色體上，分別稱為CHD-Z與CHD-W。由於CHD-Z與CHD-W在序列上略有差異，使用特異性設計的CHD primer進行PCR時，會同時擴增出大小不同的兩個基因片段。經凝膠電泳分析後，僅出現一條條帶者，為CHD-Z的PCR產物，表示為雄性（ZZ）；出現兩條不同條帶者，則表示同時具有CHD-Z與CHD-W的產物，為雌性（ZW）。

參、實驗藥品與器材：

Part 1 PCR

2X Powerpol MasterMix、ddH₂O、北京鴨（Pekin）DNA、土番鴨（Mule）DNA、番鴨（Muscovy）DNA、CHD primer (Forward)、CHD primer (Reverse)、CAUD006 primer (Forward)、CAUD006 primer (Reverse)、pipetman、tips、八連 PCR管1個、1.5 ml Eppendorf 2個、聚合酶鏈式反應儀

Part 2 RFLP

2X Powerpol MasterMix、ddH₂O、rCutSmart Buffer、Sma1 酵素、Sma1 primer (Forward)、Sma1 primer (Reverse)、pipetman、tips、八連 PCR管1個、1.5 ml Eppendorf 1個

Part 3 凝膠電泳

1X TAE buffer、LE agarose powder、Gel stain、DNA 1kb ladder、微波爐、模具、pipetman、tips、電泳槽

肆、實驗步驟：

Part 1 PCR

1. 將62.5μl 2X Powerpol MasterMix、52.5μl ddH₂O、2.5μl CHD primer (Forward)與2.5μl CHD primer (Reverse)以pipetman加入其中一個Eppendorf中混和均勻。

2. 將62.5μl 2X Powerpol MasterMix、52.5μl ddH₂O、2.5μl CAUD006 primer (Forward)與2.5μl CAUD006 primer (Reverse)以pipetman加入另一個Eppendorf中混和均勻。

3. 於前四管的八連 PCR管中，各加入24μl含有CHD primer的溶液，再依序加入1μl的北京鴨DNA、土番鴨DNA、番鴨DNA和ddH₂O。

4. 於後四管的八連 PCR管中，各加入24μl含有CAUD006 primer的溶液，再依序加入1μl的北京鴨DNA、土番鴨DNA、番鴨DNA和ddH₂O。

5. 於八連 PCR管上做好記號後，將其放入聚合酶鏈式反應儀中進行PCR。

Part 2 RFLP

1. 將62.5μl 2X Powerpol MasterMix、52.5μl ddH₂O、2.5μl Sma1 primer (Forward)與2.5μl Sma1 primer (Reverse)以pipetman加入Eppendorf中混和均勻。

2. 將八連 PCR管剪成兩組，每組四管。

3. 於其中一組PCR管中，各加入24μl含有Sma1 primer的溶液，再依序加入1μl的北京鴨DNA、土番鴨DNA、番鴨DNA和ddH₂O。

4. 於處理好的一組PCR管上做好記號後，將其放入聚合酶鏈式反應儀中進行PCR。

5. 於剩餘的一組PCR管中，各加入rCutSmart Buffer、ddH₂O與Sma1 酵素，再依序加入步驟四處裡好的四種PCR產物。

6. 於PCR管上做好記號後，放入聚合酶鏈式反應儀，先以25°C使其反應15分鐘，再以65°C破壞酵素20分鐘，使其停止反應，最後於4°C保存。

Part 3 凝膠電泳

1. 將20ml 1X TAE buffer、0.3g LE agarose powder與1μlGel stain微波加熱至透明澄清後，倒入模具中冷卻定型。重複步驟，製備兩塊凝膠。

2. 將其中一塊凝固的凝膠取出，至於電泳槽中，於前四個凝膠洞中依序加入5μl以CHD primer進行PCR的PCR產物。再於後四個凝膠洞中依序加入5μl以CAUD006 primer進行PCR的PCR產物。最後於中間的凝膠洞中加入5μl DNA 1kb ladder。

3. 將另外一塊凝固的凝膠取出，置於電泳槽中，於前四個凝膠洞中依序加入5μl未以Sma1 酵素進行剪切的PCR產物。再於後四個凝膠洞中依序加入5μl以Sma1 酵素進行過剪切的PCR產物。最後於中間的凝膠洞中加入5μl DNA 1kb ladder。

4. 進行電泳分析並記錄。

陸、實驗結論

根據使用CHD primer進行PCR的組別之電泳結果，出現兩條條帶的北京鴨與番鴨應為雌性，而僅出現一條條帶的土番鴨則為雄性。 

由以CAUD006 primer進行PCR的組別之電泳結果可見，雖然北京鴨並未出現結果，但土番鴨與番鴨的電泳結果有明顯分別，故可以用CAUD006 primer區分土番鴨與番鴨。

僅以Sma1 primer進行PCR的組別之電泳結果，由於並未以Sma1 酵素剪切，三種鴨子的電泳結果一致。

由以Sma1 酵素剪切後的組別之電泳結果可見，北京鴨與土番鴨皆出現三條條帶，番鴨則只出現一條，故可以用Sma1 酵素區分番鴨與另外兩種鴨子

柒、參考資料

國立清華大學 甚麼是PCR

Bioptic lnc 限制性片段長度多態性（RFLP）