光合作用 :

光反應之探索

DAY 4 全日課程

授課老師 : 林立元教授

學習內容

分光光度計的基礎操作
測定溶液濃度變化對吸收率之影響與計算
吸收光譜測定與數據解析
光反應中葉綠體內部變化
光合作用的能量轉換

上午實驗整理

壹、實驗目的：

學習分光光度計的使用方法，透過觀察吸收常數的變化推知濃度對吸收率的影響
利用程式繪製吸光值的標準曲線與其回歸直線，形成吸收光譜，呈現實驗結果

貳、實驗原理：

分光光度法

分光光度法是一種用來分析物質吸收特定波長之光線能力的方法。根據某物質對不同波長光線的吸收程度變化，可以繪製該物質的吸收光譜，了解其對各色光的吸收狀況，也可以用相同波長的燈卡測定不同濃度的溶液，探討稀釋倍率和吸光值的關係。

↑↑↑圖片來源：Chat GPT

A：吸光度（無單位）

T：透光率（Transmittance）

=I /I0

I0：原始光強度

I：穿過樣品後的光強度

比爾-朗博定律（Beer-Lambert law）

Abs.=E⋅C⋅L

Abs.：吸光度常數

E：物質吸光係數（Absorptivity or Molar Extinction Coefficient，跟物質性質以及波長有關）

C：濃度（mol/L）

L：比色管光徑（通常是 1 cm）

比爾-朗博定律是指吸收物質的吸光度與濃度之間的線性關係，可用來計算透射光束在通過介質時光強度的變化，在研究上廣泛應用於分光光度法以及比色分析法。在生命科學領域則可以幫助測量蛋白質濃度、DNA濃度和藥品濃度，或是藉由繪製吸收光譜來了解物質特性，以及與大氣散射同時考慮，來解釋天文學中陽光與星光通過大氣層時變得黯淡的現象。

參、實驗藥品與器材：

濃度影響吸光值之探討與光譜儀判讀

分光光度計、比色管（Cuvette）、Pipetman、Tips、各波長燈卡（405nm、515nm、590nm、615nm、648nm）、紅墨水、ddH₂O

光譜儀

清大自行設計。非常高級，可以很絲滑的打開蓋板。

紫外-可見光分光光度計

也是很神奇的機器，線段圖形之頂點即吸光值最高之光波長。

比色管(Cuvette)

容量2ml，透明管壁部分不可用手碰觸以免留下指紋影響實驗結果。

肆、實驗步驟：

各波長燈卡吸光值

將405nm燈卡插入分光光度計並進行校準（按壓右側紅色Ref按鈕），將機器打出的光強度R設定為100
於Cuvette中以Pipetman及Tip加入2毫升紅墨水(下稱管1)，插入分光光度計孔槽中，按壓左側黃色Abs按鈕並記錄螢幕上顯示之吸光值，填入表格中
輪流更換不同波長的燈卡並一一記錄吸光值於表格中

繪製標準曲線

選用上一個實驗中紅墨水吸光值最高之燈卡（515nm），將其插入分光光度計並進行校準（按壓右側紅色Ref按鈕），將機器打出的光強度R設定為100
將管1插入分光光度計，按壓左側黃色Abs按鈕並記錄螢幕上顯示之吸光值，填入表格中
取一新Cuvette(下稱管2)，使用Pipetman及Tip在其內加入1毫升管1內容物及1毫升ddH₂O，以管2取代管1重複步驟2
取一新Cuvette(下稱管3)，使用Pipetman及Tip在其內加入1毫升管2內容物及1毫升ddH₂O，以管3取代管2重複步驟2
以此類推，不斷重複取新Cuvette並使用Pipetman及Tip吸取前一管Cuvette中內容物1毫升和ddH₂O1毫升加入，使稀釋倍率一直保持2的整數次方
直到所顯示之吸光值小於1，即以該稀釋倍率為基準1，繪製一個新表格，重複進行實驗直到稀釋倍率為1/16
將實驗所得知之稀釋倍率作為x軸，吸光值作為y軸，將數值輸入EXCEL程式，繪製稀釋倍率對吸光值之標準曲線
稀釋倍率1/16的紅墨水溶液以紫外-可見光分光光度計測量，得其對各波長光線之吸收狀況

伍、實驗結果

各波長燈卡吸光值實驗數據

紅墨水之吸光值以對515nm綠光波長時為最高，405nm藍紫光為次，其餘黃、橘、紅光之吸光值皆遠小於1

稀釋倍率對吸光值之標準曲線

以紅墨水稀釋倍率作為x軸，吸光值作為y軸，可得一相關係數為0.9985，與線型函數高度正相關曲線

紫外-可見光分光光度計讀取結果

標記的最高處表示此紅墨水溶液對波長515nm之綠色光吸收率最高

下午實驗整理

壹、實驗目的：

了解光反應抑制劑DCMU的作用
了解葉綠素對可見光的吸收特性及在光合作用中扮演的角色

貳、實驗原理：

【全黑】、【照光】

在光反應中，葉綠素吸收光能後，會於類囊體膜上進行一連串電子傳遞反應，過程中輔酶 NADP⁺會接收一個電子還原為 NADPH。在本實驗中則是使用一種人工電子接受體 DCIP來取代 NADP⁺，氧化態的 DCIP 呈藍色，當它被還原時會變成無色的，再配合由上午實驗與課程所得知吸光值隨溶液濃度、顏色變化之規律，觀察吸光值變化即可作為葉綠素是否進行光反應的指標。

【加DCMU】

光反應抑制劑 DCMU會阻斷光系統 II（PSII）與質體醌（plastoquinone）之間的電子傳遞，使 DCIP 無法被還原而變成無色，在這種情況下比較照光組與加 DCMU 組的吸光值變化，可驗證 DCIP 的還原確實是來自於未被破壞的光合作用電子傳遞鏈。