微生物學實驗

DAY 1  下午課程 

授課老師 :  藍忠昱 教授

• 三域系統介紹

• 分子生物學中心法則簡介

• 簡單染色法與革蘭氏染色法練習

壹、實驗目的：

1. 學習顯微鏡油鏡的使用方法，並以此觀察玻片樣本。

2. 學習簡單染色法與革蘭氏染色法。

貳、實驗原理：

簡單染色

結晶紫是一種帶正電的染料，會與細菌細胞壁中帶負電的成分（如肽聚醣層）結合，從而達到染色的效果。

革蘭氏染色

革蘭氏染色法，是一種用於初步辨識細菌的染色方法，由丹麥醫師漢斯 ∙ 克里斯蒂安 ∙ 革蘭於1884年所發明。結晶紫在與碘液反應後，會形成結晶紫-碘（CV-I）複合物，使其分子體積變大。由於革蘭氏陽性菌的細胞壁具有較厚的肽聚醣層，且脂質含量較低，當僅加入乙醇時，少量脂質被溶解，在細胞壁上形成細小孔洞，而這些孔洞會因乙醇的脫水作用而收縮封閉，使CV-I複合物不易逸出，細菌因此呈現紫色。革蘭氏陰性菌的細胞壁則具有較薄的肽聚醣層，且其外層覆蓋有一層由脂多醣構成的外膜。因此，當加入乙醇時，外膜中大量的脂質會被溶解，形成較大的孔洞。這些孔洞即使蛋白質因脫水而收縮，也不易封閉。加上肽聚醣層太薄，無法有效固定CV-I複合物，使其容易釋出，菌體因此呈現無色。這樣的特性，使得在加入番紅進行回染後，革蘭氏陽性菌仍保持紫色，而無色的革蘭氏陰性菌則因重新染色而呈現紅色。如此就能依顏色區分兩種細菌。

參、實驗藥品與器材：

簡單染色

大腸桿菌、結晶紫、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鏡油、洗滌瓶、酒精燈、打火機、鑷子、滴管、Tips

革蘭氏染色

大腸桿菌、枯草桿菌、結晶紫、碘液、95%酒精、番紅、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鏡油、洗滌瓶、酒精燈、打火機、鑷子、滴管、Tips

肆、實驗步驟：

簡單染色

1. 於載玻片上滴一滴水，用Tip刮取少量大腸桿菌，與載玻片上的水均勻混和。

2. 使用鑷子夾起玻片，於酒精燈上來回移動，將水滴烤乾，使大腸桿菌得以固定於玻片上。（須注意一定要來回移動的烤，不能使玻片的同一個位置被加熱太久，否則可能導致細菌烤焦或玻片破裂，無法進行實驗。）

使用滴管將結晶紫滴在大腸桿菌上40秒。

3. 將玻片一端抬起，使用洗滌瓶沖洗玻片上端，使流下的水流可以洗去多餘的結晶紫，直至流出的水變得乾淨透明。

4. 使用擦手紙將玻片背面擦乾。

5. 於大腸桿菌上方蓋上蓋玻片，置於顯位鏡下方，於40倍物鏡下調整載玻片的位置，使想要觀察的大腸桿菌位於視野正中央，並拍照紀錄。

6. 使用100倍油鏡觀察並拍照紀錄。

革蘭氏染色

1. 於載玻片左右各滴一滴水，用兩枝Tips分別刮取少量大腸桿菌和枯草桿菌，與載玻片上的兩滴水分別均勻混和。

2. 使用鑷子夾起玻片，於酒精燈上來回移動，將水滴烤乾，使大腸桿菌和枯草桿菌得以固定於玻片上。

3. 使用滴管將結晶紫分別滴在兩種細菌上各10秒。

4. 將玻片一端抬起，使用洗滌瓶沖洗玻片上端，直至流出的水變得乾淨透明。

5. 使用擦手紙輕輕將玻片正面的水吸乾（注意不要擦掉細菌）。

6. 使用滴管將碘液滴在兩種細菌上各10秒。

7. 重複步驟4。

8. 將玻片一端抬起，使用95%酒精沖洗玻片上端，直至流出的酒精變得乾淨透明。

9. 重複步驟4。

10. 使用滴管將番紅滴在兩種細菌上各10秒。

11. 重複步驟4。

12. 使用擦手紙將玻片背面擦乾。

13. 於兩種細菌上方分別蓋上蓋玻片，置於顯位鏡下方，於40倍物鏡下調整載玻片的位置，使想要觀察的細菌位於視野正中央，並拍照紀錄。

14. 使用100倍油鏡觀察並拍照紀錄。

一、簡單染色

二、革蘭氏染色

陸、實驗結論

大腸桿菌在革蘭氏染色後呈紅色，可知大腸桿菌為革蘭氏陰性菌。而枯草桿菌在革蘭氏染色後呈紫色，可知枯草桿菌為革蘭氏陽性菌。

柒、參考資料

東吳大學 革蘭氏染色