DAY 4 全日課程
授課老師 : 林立元 教授
學習內容
分光光度計的基礎操作
測定溶液濃度變化對吸收率之影響與計算
吸收光譜測定與數據解析
光反應中葉綠體內部變化
光合作用的能量轉換
上午實驗整理
壹、實驗目的:
學習分光光度計的使用方法,透過觀察吸收常數的變化推知濃度對吸收率的影響
利用程式繪製吸光值的標準曲線與其回歸直線,形成吸收光譜,呈現實驗結果
貳、實驗原理:
分光光度法
分光光度法是一種用來分析物質吸收特定波長之光線能力的方法。根據某物質對不同波長光線的吸收程度變化,可以繪製該物質的吸收光譜,了解其對各色光的吸收狀況,也可以用相同波長的燈卡測定不同濃度的溶液,探討稀釋倍率和吸光值的關係。
↑↑↑圖片來源:Chat GPT
A:吸光度(無單位)
T:透光率(Transmittance)
=I /I0
I0:原始光強度
I:穿過樣品後的光強度
比爾-朗博定律(Beer-Lambert law)
Abs.=E⋅C⋅L
Abs.:吸光度常數
E:物質吸光係數(Absorptivity or Molar Extinction Coefficient,跟物質性質以及波長有關)
C:濃度(mol/L)
L:比色管光徑(通常是 1 cm)
比爾-朗博定律是指吸收物質的吸光度與濃度之間的線性關係,可用來計算透射光束在通過介質時光強度的變化,在研究上廣泛應用於分光光度法以及比色分析法。在生命科學領域則可以幫助測量蛋白質濃度、DNA濃度和藥品濃度,或是藉由繪製吸收光譜來了解物質特性,以及與大氣散射同時考慮,來解釋天文學中陽光與星光通過大氣層時變得黯淡的現象。
參、實驗藥品與器材:
濃度影響吸光值之探討與光譜儀判讀
分光光度計、比色管(Cuvette)、Pipetman、Tips、各波長燈卡(405nm、515nm、590nm、615nm、648nm)、紅墨水、ddH₂O
清大自行設計。非常高級,可以很絲滑的打開蓋板。
也是很神奇的機器,線段圖形之頂點即吸光值最高之光波長。
容量2ml,透明管壁部分不可用手碰觸以免留下指紋影響實驗結果。
肆、實驗步驟:
各波長燈卡吸光值
將405nm燈卡插入分光光度計並進行校準(按壓右側紅色Ref按鈕),將機器打出的光強度R設定為100
於Cuvette中以Pipetman及Tip加入2毫升紅墨水(下稱管1),插入分光光度計孔槽中,按壓左側黃色Abs按鈕並記錄螢幕上顯示之吸光值,填入表格中
輪流更換不同波長的燈卡並一一記錄吸光值於表格中
繪製標準曲線
選用上一個實驗中紅墨水吸光值最高之燈卡(515nm),將其插入分光光度計並進行校準(按壓右側紅色Ref按鈕),將機器打出的光強度R設定為100
將管1插入分光光度計,按壓左側黃色Abs按鈕並記錄螢幕上顯示之吸光值,填入表格中
取一新Cuvette(下稱管2),使用Pipetman及Tip在其內加入1毫升管1內容物及1毫升ddH₂O,以管2取代管1重複步驟2
取一新Cuvette(下稱管3),使用Pipetman及Tip在其內加入1毫升管2內容物及1毫升ddH₂O,以管3取代管2重複步驟2
以此類推,不斷重複取新Cuvette並使用Pipetman及Tip吸取前一管Cuvette中內容物1毫升和ddH₂O1毫升加入,使稀釋倍率一直保持2的整數次方
直到所顯示之吸光值小於1,即以該稀釋倍率為基準1,繪製一個新表格,重複進行實驗直到稀釋倍率為1/16
將實驗所得知之稀釋倍率作為x軸,吸光值作為y軸,將數值輸入EXCEL程式,繪製稀釋倍率對吸光值之標準曲線
稀釋倍率1/16的紅墨水溶液以紫外-可見光分光光度計測量,得其對各波長光線之吸收狀況
伍、實驗結果
紅墨水之吸光值以對515nm綠光波長時為最高,405nm藍紫光為次,其餘黃、橘、紅光之吸光值皆遠小於1
以紅墨水稀釋倍率作為x軸,吸光值作為y軸,可得一相關係數為0.9985,與線型函數高度正相關曲線
標記的最高處表示此紅墨水溶液對波長515nm之綠色光吸收率最高
下午實驗整理
壹、實驗目的:
了解光反應抑制劑DCMU的作用
了解葉綠素對可見光的吸收特性及在光合作用中扮演的角色
貳、實驗原理:
【全黑】、【照光】
在光反應中,葉綠素吸收光能後,會於類囊體膜上進行一連串電子傳遞反應,過程中輔酶 NADP⁺會接收一個電子還原為 NADPH。在本實驗中則是使用一種人工電子接受體 DCIP來取代 NADP⁺,氧化態的 DCIP 呈藍色,當它被還原時會變成無色的,再配合由上午實驗與課程所得知吸光值隨溶液濃度、顏色變化之規律,觀察吸光值變化即可作為葉綠素是否進行光反應的指標。
【加DCMU】
光反應抑制劑 DCMU會阻斷光系統 II(PSII)與質體醌(plastoquinone)之間的電子傳遞,使 DCIP 無法被還原而變成無色,在這種情況下比較照光組與加 DCMU 組的吸光值變化,可驗證 DCIP 的還原確實是來自於未被破壞的光合作用電子傳遞鏈。
氧化態DCIP呈藍色,還原態DCIP呈無色
↑↑↑圖片來源:黃詩婷助教上課PPT
PSI (光系統 I ) 光反應中的蛋白質複合體,吸收光能以將 NADP⁺ 還原成 NADPH
PSII (光系統 II) 光反應中的蛋白質複合體,吸收光能並分解水產生 O₂、電子和 H⁺
PQ (質體醌) 可移動的電子傳遞分子,負責將電子從 PSII 傳至細胞色素複合體。
↑↑↑圖片來源:林立元教授上課PPT
參、實驗藥品與器材:
葉綠體光反應實驗
新鮮菠菜、研缽、茶葉濾袋、0.05% DCIP、1mM DCMU、0.5M 蔗糖水溶液、Pipetman、Tips、燒杯、Cuvette、光譜儀、量筒、手電筒、冰塊、保麗龍箱
肆、實驗步驟:
前置準備
取2g洗乾淨的菠菜葉片剝碎放入研缽中,置於保麗龍箱中冰塊上,加入10ml 0.5M 蔗糖水溶液,磨碎
磨碎後的粗萃取液以茶葉濾袋進行過濾,完成葉綠體的分離(需置於冰塊上保冰並蓋上蓋子避光)
取一Cuvette,加入葉綠體濾液後測量其在590nm燈卡下的吸光值(A590),用0.5M 蔗糖水溶液稀釋至吸光值為0.4~0.6為佳
【全黑】
步驟3之Cuvette中再加入100 µl DCIP,混合均勻後測量A590,作為zero time control
將Cuvette留在光譜儀中,蓋上頂蓋避光,每30秒記錄一次吸光值,記錄至2分鐘
【照光】
步驟3之Cuvette中再加入100 µl DCIP,混合均勻後測量A590,作為zero time control
將Cuvette留在光譜儀中,用手電筒從Cuvette上方貼附著照射,每30秒記錄一次吸光值,記錄至2分鐘
【加DCMU】
先加入100 µl DCMU,反應2分鐘後再加入100 µl DCIP
將Cuvette留在光譜儀中,用手電筒從Cuvette上方貼附著照射,每30秒記錄一次吸光值,記錄至2分鐘
伍、實驗結果
吸光值在達到平衡後理論上不再變動
吸光值在加入DCIP後變大,照光反應後再逐漸降低(DCIP還原由藍色轉為無色)直到反應完成
加入DCMU後,DCIP的還原反應被抑制,無法被還原轉為無色,因此吸光值下降幅度很小
實驗步驟:清華大學課程講義、黃詩婷助教上課PPT
專有名詞翻譯:維基百科、Chat GPT