分子遺傳學實驗

授課老師:黃貞祥老師

課程內容:

1.認識台灣常見的鴨種品系及其各品種之間的親緣關係

2.實驗--利用PCR分子標記探究台灣鴨種身世之謎

第一部分:實驗DNA來源的鴨種品系

北京鴨(圖片來源：中國農業大學新聞網)

學名：Ahas platyrhynchos Var. domestica

俗名：Pekin Duck

原產地：中國華北

番鴨(圖片來源：福智全球資訊網)

學名：Cairina moschata

俗名：Black Muscovy

原產地：南美洲秘魯

土番鴨(圖片來源：農委會畜產試驗所)

學名：Cairina Anac 

俗名：Mule Duck 

原產地：台灣 

資料來源：台灣鴨種-鴨鴨知趣-博士鴨https://www.dr-duck.com.tw/edcontent.php?lang=tw&tb=11

第二部分:PCR實驗

實驗目的:

        將"北京鴨"、"番鴨"、"土番鴨"三種台灣常見鴨類品種的DNA經過PCR連鎖反應後藉由電泳實驗跑膠觀察其親緣關係並比較樣本在使用"限制酶"內切前後的差異。

實驗一共分為三部分，而在實驗中，我們會使用到"微量吸管(pipetman)"

(圖片來源：Wikimedia Commons)


PART A

聚合酶連鎖反應(PCR)

(此步驟樣本製成由他組負責)

實驗材料:

1. 2x Powerpol MasterMix:110μl

2.ddH2O 300μl

3.Duck DNA:

Pekin,Mule,Muscovy 5μl each

4.1.5ml Eppendorf *2

5.八連PCR管*1

引子:(以下皆為5μl)

CHD primer (Forward)

CHD primer (Reverse)

CAUD006 primer (Forward)

CAUD006 primer (Reverse)



(圖片來源：Wikimedia Commons)


PART B

限制酶核酸內切

             (此步驟樣本製程由我們組別負責)

實驗材料:

1. 2x Powerpol MasterMix:110μl

2.ddH2O 300μl

3.rCutSmart buffer 20μl

4.Smal酵素(由助教協助我們加入)

5.八連PCR管*1

引子:(以下皆為5μl)

Smal primer (Forward)

Smal primer (Reverse)



PART C

凝膠電泳分析實驗

(此步驟的製膠過程由他組負責)

製膠材料:

PART B 實驗過程

1.將ddH2O 42μl、50μl 2x MasterMix、2μl Smal primer(Forward)、2μl Smal primer (Reverse)依體積大小由大而小利用Pipetman依序加入TUBE中，共獲得體積96μl之混合液。

2.將混合液分裝至已標明為"Pekin"、"Mule"、"Musc"、"NC"的四聯管中，每管24μl平分。再分別將1μl對應DNA加入。

3.每管各加入對應PCR產物20μl、rCutSmart buffer 5μl、ddH2O 24μl、Smal enzyme 1μl，至此每管共50μl

4.讓酵素反應(15分鐘 攝氏25度) ，再殺死酵素(20分鐘 攝氏65度)、保存樣品(攝氏4度)

PART C 實驗過程

1.將PART A與PART B 製成的八管PCR產物如右圖(擷取自上課講義)方式排列，並且以Pipetman汲取注入他組已經事先準備好的洋菜膠電泳跑道。

2.通電跑膠並觀察實驗結果。

3.將已經跑膠完的成果置入UPV中照射紫外光

4.利用步驟3的結果觀察並分析三種鴨類的親緣關係圖


用pipetman吸取液體

進行試管標記

在四個試管注入PCR反應材料

電泳槽裡注入樣本

電泳槽結果

取出膠體

實驗結果


左至右1~9行分別為：

1.Sma1 Pekin

2.Sma1 Mule

3.Sma1 Muscovy

4.Sma1 Native control

5.DNA 1kb ladder





6.沒東西~

7.Sma1 cut Pekin

8.Sma1 cut Mule

9.Sma1 cut  Muscovy

10.Sma1 cut Native control

討論

結論

1、本次實驗使用之限制性內切酶，切割北京鴨與土番鴨經PCR複製之DNA效果明顯，而對番鴨之基因無明顯效果

2、進一步分析可以推論土番鴨與北京鴨可能有親緣關係

3、經由文獻查詢得知，土番鴨為改鴨與番鴨交配的子代，而改鴨是北京鴨與菜鴨交配所生，與實驗結果相符