台灣鋏蠓(Forcipomyia taiwana, 俗稱小黑蚊)主要分布於臺灣中、南部及東部地區。近年來,其危害地區已由以往較為偏僻的鄉鎮,漸漸向都市擴散。本校所在地的台中市大坑地區深受小黑蚊之危害,除了嚴重干擾本校師生及附近居民的日常作息外,亦對遊客造成極大的困擾,影響當地觀光產業之發展,造成經濟上莫大的損失。有鑑於小黑蚊的本土特色及地區特有問題等重要性,本校於九十三年度提出「以小黑蚊為模式生物進行基因體學、生物資訊學與昆蟲防治」之教學與研究整合型計畫,並獲得教育部「發展學校重點特色」之專案經費補助,執行下列各項子計畫:
一、EST (expressed sequence tag) 基因庫及其網頁之建構
在此一計畫的執行期間本校研究團隊構築完成一個至少擁有二萬個選殖株的cDNA基因庫,並已定序1,200條序列(圖一)。由序列分析可發現:
(一)、所有序列均與蚊子、果蠅呈現較高的同源性,顯示這些序列確實來自小黑蚊。
(二)、其中絕大部分的解碼序列為完整之基因序列,同時擁有前端的CAP site以及尾端的Poly(A) tail。
(三)、序列間雖有部分區重疊,但不盡相同,顯示各個選殖株均源自不同的mRNA分子,在基因庫中並無明顯之重複情形發生。
(四)、其中有6個選殖株的序列與基因庫之資料無同質性,應為首次發現之新蛋白質。
二、分子分類標記鑑定分析及病原攜帶之研究
在分子分類方面的研究結果顯示小黑蚊粒線體DNA區域(COII)及核內基因體中RNA基因區(18S rRNA)之分類標記鑑定與傳統分類吻合,小黑蚊之序列與同屬於雙翅目之昆蟲具有較高的相似性,而鞘翅目、鱗翅目等在型態及分類上與小黑蚊差異較顯著的昆蟲,其相似度則較低。由所得COII DNA序列變化數據推估,台灣小黑蚊具有多種單基因型(haplotypes)(圖二),而單基因型分歧之起源可溯至2百萬年前。這些小黑蚊族群中的序列變化與其在台灣北部、南部與東部之地理分布並無明顯關係(圖三)。各地區內各具多種單基因型,且相互重疊。推論小黑蚊之不同演化分支可能在不同冰河時期分別自中國大陸地區進入台灣島,因而建立具多樣性之族群。之後可能因人類族群遷移的介入,得以分散至全島各地區。
三、唾腺體cDNA基因庫及其過敏原表現系統之建構,及以本校教職員工及學生為群聚體之社區健康評估由於小黑蚊對人類造成最大的困擾,乃在於其對人類叮咬後,所造成的過敏反應,因此找出過敏原與建立有效之防護措施,乃是刻不容緩的事。對此,在九十三年度計畫中亦建立有效之過敏原篩選及表現系統,並透過衛教宣導防範小黑蚊對於本校師生之危害。
現階段研究
一、國科會「提升私校研發能量專案計畫」
為延續九十三學年度教育部技專校院「發展學校重點特色」專案--建立「以小黑蚊為模式生物進行基因體學、生物資訊學與昆蟲防治」之教學與研究整合型計畫,本校於九十四年度提出「台灣鋏蠓(小黑蚊)功能基因體研究」之群體型計劃,整合基因體學、蛋白質體學、分子生物學、生物資訊學、蛋白質結構學、實驗動物學等領域科學,利用小黑蚊基因庫、唾腺cDNA基因庫所蒐集之序列,做為分子分類和物種鑑定之依據,並應用於小黑蚊之基礎研究,探討小黑蚊特有基因之功能與結構以及其基因之調控機轉。藉由這些資訊的蒐集,針對幼蟲到成蟲乃至於交配等各個不同發育及生長階段,發展有效的防治策略,杜絕小黑蚊之危害。此外小黑蚊之雌蚊嗜吸人血,因此可能透過其叮咬過程散佈病原。雖然目前台灣相關研究並未發現小黑蚊傳播任何疾病。但在福建和廣東早期的少數研究中,曾於小黑蚊體內分離出日本腦炎病毒,可見其成為病媒蚊之潛力。因此本計畫亦針對小黑蚊之病原攜帶或傳染進行檢測。此一群體型計劃已獲得國科會「提升私校研發能量專案計畫」之三年期補助,目前執行進度已進入第三年,第一及第二年的計畫成果如下:
(一)、小黑蚊化學感應蛋白(chemosensory protein, CSP)之功能探討與結構分析
經由序列比對在小黑蚊之cDNA基因庫中發現4個序列與化學感應蛋白具有很高的相似性。CSP為小分子之分泌性可溶蛋白,主要分布於昆蟲的感覺器官中。目前已知CSP可與脂肪酸及費洛蒙的
類似物結合,因此推測CSP可能參與嗅覺的偵測,引導昆蟲搜尋獵物,或是透過費洛蒙的辨識,找尋異性伴侶。本計劃首先利用PCR及DNA定序,針對csp的基因結構進行分析,序列的分析結果顯示小黑蚊之csp基因具有一個intron以及兩個exon。針對蛋白質的部份,目前已自大腸桿菌中成功地表現小黑蚊CSP蛋白,經由純化後純度可達97%,進一步的結構性及功能性分析顯示小黑蚊CSP蛋白之二級結構是以a-helix為主(圖四),並能與長鏈之脂肪酸或醇類結合(圖五)。西方墨點法的分析則顯示CSP於各個體節中皆有分佈(圖六)。在未來的應用方面,則利用上述可與CSP結合之ligand進行小黑蚊嗅覺測試,若對小黑蚊具吸引力則可發展為誘捕劑,配合殺蟲劑進行誘殺,或者將此一ligand噴灑於田間,影響小黑蚊的嗅覺辨識,使其無法尋獲叮咬對象,以達到防制的目的。
(二)、小黑蚊病原媒介潛在性之研究及其細胞株建立
就病原篩檢部份,目前已針對台灣中、南部地區(台中、彰化、南投、雲林、台南)之小黑蚊進行攜帶病原之調查,在不同縣市與不同季節的數次分析中,經由PCR與DNA定序反應後,於台南縣的檢體中,首次出現B型肝炎病毒(hepatitis B virus)之陽性訊號(圖七),將此序列經遺傳演化樹分析,此病毒株核苷酸序列與2002年台灣肝炎中心所分離之樣本,具有93.7 %的相似性,也與2003年中國所分離之樣本有極高的同源性(圖八、圖九),因此小黑蚊確實具有成為病媒蚊之潛能,此結果為初步的警訊,而B型肝炎病毒是否可透過小黑蚊傳播,尚待進一步研究。另外在台灣流行病學上極為重要的日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)與登革熱病毒(Dengue virus),於近兩年春、夏二季(豬隻體內存在抗體的高峰期為3-5月間)養豬場環境中所採集之小黑蚊樣本中,皆無陽性結果出現。
二、臺中市環保局「大坑地區小黑蚊棲群密度監測、防治成效評估及宣導計畫」
近年來全球受到溫室效應導致氣候變遷,而台灣全年氣候之變化也深受影響,小黑蚊之棲群密度與擴散範圍也日益加劇,故小黑蚊全年密度之變化實有必要進行長期之調查,以做為政府擬定防範措施與防治之參考依據。因此,本校九十五及九十六年度接受臺中市環境保護局委託,針對大坑地區小黑蚊危害最為嚴重之民德、東山、民政、廍子、大坑及和平等六里進行小黑蚊密度監控,評估化學防治之效果(圖十)。本試驗每兩週定期進行一次密度調查,每人以單一裸露的小腿進行20分鐘的誘集(隻/人/20分鐘),所誘集的雌蟲數代表該地區之小黑蚊棲群密度,並進行天候因子與小黑蚊棲群密度變化相關性分析。其中「薇納市社區」、「光正國小」及「山河戀」之棲群密度年平均數較其他調查點為低,推測其原因為此三處地勢較該里其他調查點高、排水規劃完善、環境整潔等因素,使得其小黑蚊密度遠遠低於其他社區,故乾燥及整潔的環境為減少小黑蚊棲群密度的重要方法,此一觀察可做為未來防制工作之參考依據。另外,此一計畫亦同時進行小黑蚊生態與防治宣導活動,將小黑蚊生態與防制觀念在各學校及社區散播。
參、未來的防制規劃
台中市大坑地區深受小黑蚊之危害,除了嚴重干擾學生及居民的日常作息外,亦對遊客造成極大的困擾,深深影響當地觀光產業之發展。為配合大坑社區發展、促進地方繁榮,本校將針對小黑蚊之防制規劃下列措施:
一、利用特殊氣味進行誘捕劑
(一)、採用目前市售之蚊子誘捕劑及誘捕器進行測試;如Sweatact、BioQuip SentinelMosquito Trap、「捕蚊巫師」、「生物鎵誘蚊精靈」等。
(二)、利用CO2、乳酸、八烯醇、十二烯醇、十五烯酸、十六烯醇等具有蚊蟲誘集效果之脂肪酸及醇類進行誘集實驗。
(三)、利用臭豆腐滷水所產生的氣味進行誘集。
(四)、由較易被小黑蚊叮咬的人群皮膚上,分離能夠產生誘集氣味的菌株,於富含脂質之培養基中進行培養,然後利用培養液過程中所產生的氣味進行誘集。
二、利用生物防制方式來降低小黑蚊密度。採用可向光處織網,且孔目較為緻密的蜘蛛,利用其蜘蛛網配合誘捕劑或燈光吸引來捕捉小黑蚊。
三、減低幼蟲食物來源—利用藍綠藻專一性感染病毒噬菌體 (cyanophage) 進行噬菌體療法(phage therapy) 來降低小黑蚊幼蟲重要食物來源藍綠藻。
希望能夠藉由三大防制措施之田間試驗,達到有效控制小黑蚊族群密度之效果。