А. М. Носов, http://plantphys.bio.msu.ru/staff/nosov.htm Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН, д. б. н., МГУ, биофак, каф физиологии растений
В истории науки известно немало примеров, когда открытия, казавшиеся чистой игрой ума и не имевшие, на первый взгляд, никакого практического значения, впоследствии приводили к революционным изменениям в промышленности или сельском хозяйстве. Сказанное можно отнести к изолированным клеткам растений. Биология растительной клетки вне организма (in vitro) - очень молодой, бурно развивающийся раздел физиологии растений. Термин in vitro (дословно «в стекле») означает, что объекты выращиваются изолированно от целого организма и стерильно, т. е. в асептических условиях. Впервые растущая культура клеток моркови была получена в лаборатории Р. Готре (Франция) всего чуть более полувека назад. Вначале исследователи изолированных растительных клеток не придавали практического значения своим работам. Однако сейчас почти все современные растительные биотехнологии основаны на культуре клеток растений.
У истоков многих работ в области культуры клеток высших растений стояли отечественные ученые. Созданная членом-корреспондентом Р. Г. Бутенко в конце 50-х годов XX в. лаборатория изолированных тканей и органов растений (впоследствии Отдел биологии клетки и биотехнологии) Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук (ИФР РАН) - пионер в области изучения культур клеток высших растений не только в России, но и за рубежом. Любопытна история начала работ по культуре клеток высших растений в нашей стране. Директор Института физиологии растений, академик А. Л. Курсанов вернулся с Ботанического конгресса, который проходил в середине 50-х годов в Париже. Р. Г. Бутенко в то время была ученым секретарем Института. Андрей Львович в беседе с ней как-то упомянул: «В Париже выращивают на питательных средах кусочки тканей растений».
На естественный вопрос Раисы Георгиевны «зачем?» он ответил: «Не знаю, но красиво. Не хотите ли попробовать?» С этого разговора в нашей стране начались пионерские работы по культуре клеток высших растений, которые через полвека превратились в важнейшее направление современной физиологии растений и биотехнологии. Можно утверждать, что представление о культуре клеток высших растений как об уникальной экспериментально созданной биологической системе возникло во многом благодаря трудам Р. Г. Бутенко и ее сотрудников. Целый ряд созданных ею направлений биологии клетки и биотехнологии имели и имеют приоритетный характер.
Культура клеток высших растений - уникальная биологическая система. Культуру клеток высших растений получить, на первый взгляд, очень просто. Достаточно в асептических (стерильных) условиях взять кусочек любого органа или ткани растения и поместить на специально подобранную твердую (с добавлением агар-агара) питательную среду. В составе среды должны быть минеральные соли, сахар (для питания клеток) и, главное, - регуляторы роста (фитогормоны). Через какое-то время произойдет дедифференциация - клетки потеряют свою исходную специализацию. Это означает, что они перестанут быть, к примеру, «клеткой листа» или «клеткой паренхимы стебля», а станут своеобразными «унифицированными» растительными клетками (иногда их называют меристемоподобными клетками). Затем эти «унифицированные» клетки начинают делиться - образуется каллусная культура клеток. Последняя представляет собой сообщество делящихся и растущих клеток («каллусной» она называется из-за сходства с каллусом - раневой тканью растения; образование каллуса - первая стадия формирования каллусной культуры клеток). После определенного периода роста (обычно около месяца) небольшую часть каллуса пересаживают на свежую питательную среду для нового ростового цикла.
Таким способом, т. е. серией пересадок, постоянно поддерживается растущая культура клеток растений. Каллусные клетки можно с твердой среды пересадить в жидкую среду и поставить колбы на качалку (шейкер). Клетки каллусной культуры в этих условиях отделяются друг от друга, и через некоторое количество пересадок обычно образуется суспензионная культура клеток, в которой клетки и небольшие их агрегаты растут подобно микроорганизмам. Наконец, в особых случаях из клеток каллусной или суспензионной культуры можно получить протопласты - клетки, лишенные клеточной стенки. С этой целью клетки необходимо обработать растворами специальных ферментов. Получение протопластов важно для решения ряда практических задач.
Каковы особенности свободноживущих клеток растений в культуре? Судьба клетки в составе организма (растения) жестко определена. Для регулирования развития и работы своих клеток у растения есть много способов. Прежде всего это действие фитогормонов: ауксинов, цитокининов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты, этилена и несколько других относительно недавно открытых соединений. Ничтожные концентрации названных веществ определяют работу и развитие клеток растения. Типичные примеры: относительно высокие концентрации ауксинов вызывают формирование корней; определенная комбинация ауксинов и цитокининов «заставляет» клетку делиться. Кстати, именно они входят в состав сред для получения и выращивания культур клеток и обусловливают процесс дедифференцировки и стимулирования деления клеток.
Другой фактор, определяющий судьбу клетки, представляет ее окружение - соседние клетки и ткани. Механизмы, определяющие влияние такого окружения на судьбу клетки, до конца не установлены, известно лишь, что большую роль в них играют электрические сигналы и контактные взаимодействия. Таким образом, в составе организма судьба клетки полностью подчинена целостному организму, причем зачастую эта судьба незавидна, например, многие клетки покровных и проводящих тканей обречены на смерть и будут «работать» на организм в мертвом виде - будучи сосудами или пробкой. Судьба изолированной клетки, выращиваемой на искусственных средах, кардинально меняется. Она освобождается от «прессинга» организма. Перед ней стоит единственная задача - делиться, по возможности, как можно интенсивнее.
Главенство такой задачи обусловлено условиями свободного существования клетки: изолированные клетки волей экспериментатора существуют в «пересадочной культуре». Это означает, что культура клеток может существовать только в цепи последовательных пересадок. В подобных условиях вероятность «попадания» в следующий цикл роста выше у потомства интенсивно делящихся клеток. Другими словами, в условиях пересадочной культуры изолированных клеток происходит их отбор по признаку интенсивной пролиферации - увеличения числа клеток путем деления. Этот признак - один из основных для большинства природных популяций, например, микроорганизмов или животных. Таким образом, снятие организменного контроля развития обусловило переход клеток к популяционному контролю. Далее был сделан следующий шаг в изучении культур клеток.
Дело в том, что обязательным условием существования любой популяции является ее гетерогенность, т. е. «неодинаковость» входящих в нее особей. Действительно, если все организмы в популяции совершенно одинаковы, то любое изменение условий существования (например, внезапное похолодание или появившийся патогенный микроб) может привести к гибели всех особей. Если же популяция гетерогенна, то всегда обнаружатся особи, выжившие в изменившихся условиях, - из них восстановится целая популяция, правда, с несколько измененными характеристиками.
Когда исследователи только начинали работать со свободноживущими клетками растений, то не вызывало сомнений, что все клетки в культуре одинаковы (ведь получены они из немногих клеток одной ткани!). Решающим поворотом в изучении биологии клетки от vitro стало открытие гетерогенности входящих в нее клеток. Оказалось, что входящие в состав культуры клетки значительно различаются друг от друга, причем по разным признакам: морфологическим (форма, размер клетки, набор и число органелл), физиологическим (синтез и накопление различных веществ) и, что самое важное, - генетическим. Установлено, что свободноживущие клетки in vitro содержат различный набор хромосом - от гаплоидного (n) до окта- и декаплоидного (10-12n), при этом часто наблюдаются различные хромосомные перестройки.
Явление генетической гетерогенности культивируемых клеток открыли Р. Г. Бутенко и З. Б. Шамина. Таким образом, важнейшее следствие популяционного контроля развития системы изолированных клеток растений - ее гетерогенность на различных уровнях организаций - от геномного до клеточного. Это составляет основу адаптационных возможностей системы. Очень важно, что гетерогенность популяции культуры клеток стабильна при постоянных условиях выращивания, но изменяется при изменении внешних условий. Например, соотношение числа клеток с различным числом хромосом в популяции достаточно стабильно в течение многих пересадок (для культуры клеток диоскореи, например, доля диплоидных и триплоидных клеток в популяции приблизительно одинакова - по 35%, полиплоидных - около 20%).
При изменении условий плоидность может значительно измениться: после исключения из среды одного витамина в культуре клеток диоскореи стали преобладать полиплоидные клетки - их доля возросла до 45%. Такое поведение свободноживущих клеток - достаточно важное доказательство популяционного контроля развития этой уникальной биологической системы. Гетерогенность клеток растений in vitro - одно из основных свойств, определяющих применение культур клеток в прикладных исследованиях.
Итак, свободноживущие клетки высших растений значительно отличаются от клеток в составе целостного растения. Они представляют собой экспериментально созданную популяцию соматических клеток со многими вытекающими из этого следствиями. Чем же отличается экспериментально созданная популяция от естественной (природной) популяции, например, микроорганизмов? Основное отличие этой системы - отсутствие полового размножения ее особей (клеток). Это во-первых. Во-вторых, популяция представлена клетками растения, которые содержат полный растительный геном. Однако в условиях культуры клеток работают только те гены, которые «ответственны» за жизнедеятельность и пролиферацию самой клетки.
Следовательно, свободноживущие клетки растений in vitro имеют большое количество «неработающего» генетического материала. Все гены, которые имеют функции на уровне организма, прежде всего отвечающие за процессы роста и развития целого растения, выключены. Временная «невостребованность» таких генов повышает вероятность сохранения в клетке их измененных (мутировавших) аллелей, что, как будет показано ниже, имеет принципиальное значение для практического применения культур клеток растений. И, наконец, важнейшее свойство, присущее свободноживущей клетке in vitro, - она может дать начало новому интактному (целому) растению. Процесс формирования из дедифференцированных клеток дифференцированных структур: тканей, органов или целого растения - получил название морфогенеза in vitro, а появление интактного растения из отдельного протопласта, клетки или группы клеток - регенерации.
Полученные подобным образом растения называются растениями-регенерантами, или просто регенерантами. К регенерации способно большинство растительных клеток in vitro. Иначе говоря, полноценные растения можно получить практически из любой клетки в культуре. Это означает, что растительные клетки истинно тотипотентны, т. е. могут дать начало целому растению, что принципиально отличает их от животных, для которых формирование целого организма из соматических клеток (клонирование) возможно только из немногих стволовых клеток и является очень непростой задачей.
Процесс регенерации растения может происходить по двум механизмам - через органогенез или через соматический эмбриогенез. Органогенез in vitro - это образование (морфогенез) побегов, корней или других органов (например, цветков) из культивируемых клеток растений. Для регенерации целого растения таким способом обычно вызывают формирование побегов in vitro (для этого нужны специальный состав среды, условия освещенности и температурный режим), затем их переносят на среду для укоренения. В результате образуется интактное растение-регенерант. Другой механизм образования регенерантов - через соматический эмбриогенез в эмбриогенной культуре клеток.
Эмбриогенная культура клеток представляет собой культуру, из клеток которой в определенных условиях формируются эмбриоиды, подобные таковым из нормальной зиготы растения. Но поскольку эмбриоиды в культуре образуются не из половых, а из соматических клеток растений in vitro, они называются соматическими эмбриоидами, а процесс их образования - соматическим эмбриогенезом (эмбриоидогенезом). Из соматических эмбриоидов вырастают нормальные растения-регенеранты. Для растений-регенерантов характерно явление так называемой сомаклональной вариабельности (изменчивости). Как уже было сказано, в клетках растений in vitro активно «работают» лишь гены, ответственные за судьбу и деление самой клетки. Гены, ответственные за формирование и работу целого растения, оказываются не востребованными и их изменения (например, мутации, модификации нуклеотидов) никак не сказываются на судьбе клетки в популяции. Но когда из «свободноживущей» клетки возникнет целое растение, эти изменения проявятся. Таким образом, растения-регенеранты будут иметь различные отклонения от исходного растения.
Эти изменения (вариации) получили название сомаклональных (от слов сома - тело и «клон» - потомство, т.е. потомство соматических клеток), а полученные таким способом измененные растения-регенеранты - сомаклональных вариантов или сомаклонов. Сомаклональные изменения могут носить как качественный (окраска цветков, форма листьев, побегов и др.), так и количественный характер. Можно предположить, что чем дольше период «свободной жизни» клеток в культуре, тем больше накапливается в них изменений генома, следовательно, тем более интенсивна сомаклональная вариабельность. Это предположение полностью подтверждается в экспериментах. Более того, при очень длительном (несколько лет) выращивании клеток in vitro количество изменений становится так велико, что процесс регенерации растений становится невозможным. Впервые генетические отличия полученных из культивируемых тканей растений табака от исходных форм обнаружили в конце 60-х гг. в нашей стране Н. А. Загорская, З. Б. Шамина и Р. Г. Бутенко.
Итак, культура клеток высших растений представляет собой уникальную, экспериментально созданную биологическую систему - популяцию соматических клеток. Основные свойства такой популяции - отбор клеток по интенсивной и (или) устойчивой пролиферации, высокая степень гетерогенности на разных уровнях организации и, наконец, регенерация целого растения. Каким образом эту систему можно использовать для практических целей? В настоящее время наиболее важные области практического использования культур клеток высших растений - экология, растениеводство, промышленная биотехнология.
Экология. В настоящее время многие виды растений исчезли с лица Земли, многие находятся на грани исчезновения. Культура клеток - эффективное средство сохранения генофонда вида, а также уникальных генотипов штаммов-продуцентов. Существует несколько способов сохранения генотипов. Клетки «вне организма» можно сохранять как в живой пересадочной коллекции, так и депонировать (хранить) их при низких и сверхнизких температурах (в жидком азоте). В Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН находится Всероссийская коллекция клеточных культур высших растений, в которой депонировано около 100 различных растительных объектов (каллусные и суспензионные культуры клеток). Однако в силу особенностей культуры клеток как биологической системы (высокая гетерогенность и лабильность) такой способ сохранения генофонда не всегда надежен. Гораздо эффективнее сохранять объекты in vitro в жидком азоте при сверхнизких температурах (-196°С). Такой способ хранения получил название криосохранения, или криоконсервации.
Процесс замораживания культур клеток или меристем очень сложен: необходимо применять специальную аппаратуру, тщательно подбирать криопротекторы (специальные добавки, предотвращающие повреждение клеток), режимы и среды предварительного культивирования. В настоящее время технологии замораживания и размораживания многих растительных объектов успешно разработаны. В этой области российские исследователи также были одними из первых. Криобанк Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН организован более 30 лет назад и был одним из первых в мире.
Существуют два подхода к криосохранению растительных объектов. Если важно сохранить уникальные генотипы (ценные сорта или разновидности растений), то нельзя допускать образования популяций клеток in vitro, т.е. возникновения каллусных культур, иначе вследствие сомаклональной вариабельности могут потеряться ценные свойства сорта. В этом случае необходимы технологии криоконсервации меристем. Первым был разработан метод криосохранения меристем картофеля. Сейчас, помимо меристем картофеля, в криобанке ИФР РАН хранятся меристемы около 30 сортов земляники, нескольких сортов малины и черной смородины. При необходимости сохранения не конкретного генотипа, а генофонда вида возможна криоконсервация эмбриогенных культур клеток. В качестве примера можно привести криосохранение эмбриогенных культур клеток эндемичных видов диоскорей - кавказской (исчезающий вид) и балканской.
Благодаря криоконсервации культуры полностью сохранили способность к соматическому эмбриогенезу и из них были получены растения-регенеранты. Работы по криосохранению штаммов-продуцентов (о них будет сказано ниже) проводятся свыше 20 лет, и к настоящему времени в криобанке хранятся более 20 линий и штаммов-продуцентов. Это уникальные штаммы диоскореи дельтовидной - продуцентов фуростаноловых гликозидов, женьшеня настоящего, американского и японского - продуцентов специфических гликозидов (гинзенозидов) и ряд других ценных штаммов.
Растениеводство. В растениеводстве культура клеток в качестве инструмента используется давно, эффективно и в различных аспектах.
Использование культивируемых клеток в селекции. Методы культивирования клеток и тканей растений in vitro применяются как для повышения эффективности традиционных способов селекции, так и для выполнения задач, которые не могут быть решены стандартным путем. Создание генетического разнообразия - обязательный начальный этап любых селекционных программ. Традиционные способы расширения генетического разнообразия - внутривидовая и отдаленная гибридизации. Цель последней - передать от дикорастущих родственных видов культурным сортам ценные гены устойчивости к болезням и неблагоприятным факторам окружающей среды. При гибридизации из-за сегрегации (отделения) генотипов в F2 получается гетерогенная популяция, состоящая из растений, у которых интересующие селекционера признаки выражены в разной степени и по-разному скомбинированы с другими признаками.
В последующих поколениях продолжается расщепление, что не позволяет сразу оценить ценность полученных форм. Для стабилизации гибридных линий требуется 5-7 лет самоопыления. В результате создание нового сорта занимает в среднем 10-12 лет. Мечта любого селекционера - иметь для работы полностью гомозиготное растение, в этом случае в поколениях не будет происходить расщепления и селекционный процесс существенно сократится.
В 1964 г. индийские исследователи С. Гуха и С. Магешвари открыли возможность получения in vitro гаплоидов при культивировании пыльников на искусственных питательных средах с добавлением гормонов. Гаплоидные растения развивались из незрелых пыльцевых зерен. Установлено, что развитие пыльцевых зерен в условиях in vitro может происходить по спорофитному пути, т. е. они будут вести себя как обыкновенные растительные клетки in vitro, в частности, могут делиться и образовывать соматические эмбриоиды. Однако поскольку клетки пыльцы гаплоидны, то и соматические эмбриоиды тоже будут состоять из гаплоидных клеток. В дальнейшем при удвоении числа хромосом, происходящем спонтанно или индуцированном обработкой колхицином, возникают гомозиготные диплоидные растения, которые передают свои признаки потомству без расщепления. Таким образом, используя с целью получения гаплоидов пыльники гибридов F1, можно получать стабильные линии на 3-4 года быстрее, чем при традиционном способе.
Процесс получения растений из пыльцы назван андрогенезом. Впоследствии были подобраны условия создания гаплоидных растений и из семязачатков (неоплодотворенных зародышей).
Такой способ производства гаплоидных растений получил название гиногенез. Метод андрогенеза широко применяется в селекции злаковых и овощных культур. В ряде стран на основе использования культуры пыльников созданы высокоурожайные и устойчивые к неблагоприятным факторам сорта. Например, в Китае андрогенетические сорта пшеницы занимают площадь 70 тыс. га, а риса - 10 тыс. га. Технология получения удвоенных гаплоидов ярового ячменя и картофеля применяется при создании новых сортов в Украине (Харьков, Институт растениеводства, Одесса, Селекционно-генетический институт, Институт картофелеводства УААН, Киевская обл.). В России на основе метода андрогенеза созданы улучшенные высокоурожайные сорта риса (Краснодарский край, НИИ риса РАСХН), пшеницы (Краснодарский НИИ сельского хозяйства РАСХН), ячменя (Саратовский институт сельского хозяйства Юго-Востока РАСХН), моркови (ВНИ-ИССОК РАСХН, Московская обл.), проса (ВНИИ зернобобовых и крупяных культур РАСХН, г. Орел).
Метод культуры пыльников не только ускоряет селекционный процесс, но и делает его более эффективным. Использование андрогенеза в ранних поколениях гибридов (F1, F2) позволяет фиксировать такие сочетания признаков, которые «рассыпаются» при длительных циклах самоопыления. Кроме того, изоляция пыльников на ранних стадиях развития пыльцы позволяет сохранить генотипы, которые гибнут на разных стадиях формирования гамет и поэтому не принимают участия в формировании генетической изменчивости при самоопылении. Таким образом, метод андрогенеза дает возможность наиболее полно выявить потенциальное генетическое разнообразие гибридной популяции.
Работы по гиногенезу менее распространены, чем по андрогенезу, что связано с методическими трудностями. Однако для некоторых культур, в частности для сахарной свеклы, этот метод широко используется. При отдаленной гибридизации нередко возникает проблема несовместимости родительских геномов - гибридные зародыши гибнут на разных стадиях развития. Причиной гибели может быть отрицательное влияние тканей родительского растения на зародыш или хромосомный дисбаланс. В первом случае изоляция зародыша на возможно более ранних стадиях развития и доращивание его на питательной среде в условиях in vitro - эффективное средство спасения отдаленного гибрида. Этот биотехнологический метод, получивший название эмбриокультуры, широко применяется в селекции зерновых, бобовых и плодовых растений.
Например, во Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства РАСХН (Москва) и Всероссийском институте генетики и селекции плодовых растений РАСХН (Мичуринск) культивирование изолированных зародышей in vitro представляет собой рутинную процедуру при гибридизации вишни, черешни, сливы, алычи и груши. У злаковых эмбриокультура дает возможность получать уникальные межвидовые гибриды ячменя, скрещивать ячмень с рожью, пшеницей и даже кукурузой. Такая отдаленная гибридизация значительно повышает генетическое разнообразие, а следовательно, и «наборы»генов, которые могут быть использованы селекционером. В тех случаях, когда у отдаленных гибридов не сбалансирован хромосомный набор, можно получать каллусные ткани из гибридного зародыша.
Культивирование клеток in vitro способствует хромосомной рекомбинации, что повышает возможность выявления жизнеспособных клеток. Растения, регенерированные из каллусной ткани гибридов, обычно сохраняют большую часть генетического материала одного из родителей и отдельные фрагменты хромосом другого. Заново скомбинированный геном становится стабильным и обеспечивает жизнеспособность растения. Уникальный способ повышения генетического разнообразия, используемый в традиционной селекции наряду с гибридизацией, - применение сомаклональной вариабельности. Как было сказано, культивирование тканей in vitro способно вызывать не меньшие перестройки генома, чем химические мутагены или различные виды излучений. Возникшие в культивируемых клетках мутации сохраняются и у регенерированных из этих клеток растений.
Часто для увеличения степени генетического разнообразия используют также индуцированный мутагенез. Как и индуцированный мутагенез, сомаклональная изменчивость не является направленной, и большая часть возникающих в процессе культивирования вариаций не имеет практического значения. Но встречаются формы и с полезными признаками. Например, среди сомаклонов (измененных растений-регенерантов) сахарного тростника отобраны растения, устойчивые к вирусу Фиджи, желтой пятнистости и ложной мучнистой росе. В Венгрии выделены сомаклоны пшеницы, обладающие повышенной холодостойкостью. В отличие от гибридизации культивирование клеток in vitro не разрушает ценного сочетания генов, достигнутого в результате предыдущей селекции. Вариации затрагивают лишь отдельные участки генома. По этой причине сомаклональную изменчивость обычно используют для улучшения отдельных признаков у существующих сортов.
Эффективность использования культивируемых тканей возрастает, если выращивать клетки в селективных условиях, например, на питательных средах, содержащих токсические концентрации солей (для создания солеустойчивых вариантов), гербициды (для получения культур, устойчивых к ним), продукты жизнедеятельности фитопатогенных микроорганизмов (для получения вариантов, устойчивых к фитопатогенам). В этом случае появляется возможность на основе сомаклональных вариаций отобрать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомым признаком. Селекция in vitro позволяет обнаруживать миллионы генотипов, не занимая посевных площадей и вне зависимости от сезона и погоды. Методом клеточной селекции у многих видов культурных растений получены формы, обладающие повышенной устойчивостью к засолению, засухе, экстремальным температурам, кислым почвам, различным болезням и вредителям.
В результате отбора на средах с токсическими аналогами аминокислот выделены растения, имеющие повышенное содержание белка или белок, обогащенный ценными аминокислотами. Во ВНИИ кормов РАСХН (Московская обл.) селекцией in vitro отобраны перспективные формы клевера, люцерны и рапса, устойчивые к засолению, повышенной кислотности почвы, а также к ряду болезней, в том числе к раку клевера и фузариозу. Полученные образцы включены в создание новых сортов как исходные формы - доноры полезных генов. В результате клеточной ceлекции на средах с NaCI и полиэтиленгликолем в ТСХА (Москва) выделены растения мягкой и твердой пшеницы, толерантные к комплексу неблагоприятных условий: засухе, засолению и заморозкам. Выделенные сомаклоны хорошо зарекомендовали себя в полевых испытаниях, проведенных в Сибири и Казахстане. Переданы селекционерам полученные путем отбора in vitro в ИФР РАН растения кукурузы, толерантные к засухе. На основании пятилетних полевых испытаний сомаклонов сои отобраны ценные линии, на базе которых создан новый сорт Приморская 81. В результате многолетней работы с культивируемыми тканями риса во ВНИИ риса РАСХН (Краснодар) получено более 300 сомаклональных вариантных линий с селекционно-ценными отличиями от до-норных сортов, в частности устойчивые к соли, холоду и пирикуляриозу.
Методами традиционной селекции не удавалось получить рано созревающий рис с удлиненной зерновкой. На основе сомаклональной изменчивости и клеточной селекции получен сорт риса Биориза, сочетающий скороспелость, длиннозерность и продуктивность. В селекции картофеля улучшение имеющихся сортов по конкретным признакам и создание нового генетического материала началось в 90-х годах прошлого века. С использованием феномена сомаклональной вариабельности в российском и белорусском институтах картофельного хозяйства (ВНИИКХ и БелНИИКХ) получены сомаклоны с комплексом хозяйственно-ценных признаков. Кроме того, разработаны новые подходы, позволяющие повысить частоту встречаемости форм с желаемым признаком, а также селективные системы отбора клеток и регенерации из них растений. В результате оказалось возможным проводить клеточную селекцию с использованием в качестве селективных факторов токсинов возбудителей кольцевой гнили, черной ножки, фузариозного увядания, альтернариоза, фитофтороза.
Благодаря кокультивированию (совместному культивированию) in vitro растений с пораженными тканями и зо-оспорангиями разработаны системы для отбора клеток и растений, устойчивых к возбудителям рака картофеля и парши обыкновенной. Кроме того, для повышения эффективности клеточных технологий использован ряд стрессовых факторов (повышенные температуры, осмотический стресс, NaCI, УФ-облучение). Несколько линий картофеля, полученных методами клеточной инженерии во ВНИИКХ и БелНИИКХ, переданы в государственное сортоиспытание.
Быстрое и эффективное размножение ценных генотипов. После отбора удачных генотипов встает проблема их сохранения и активного размножения. На основании изучения экспериментального морфогенеза in vitro создана технология клепального микроразмножения растений, которая во многих странах стала уже коммерческой. Клональное размножение - разновидность вегетативного размножения с использованием техники in vitro. Оно применяется для быстрого получения большого количества растений, идентичных исходным. Клональное микроразмножение растений можно осуществлять разными способами. Наиболее распространены среди них:
• микрочеренкование пробирочных растений;
• индукция образования микроклубней и микролуковиц;
• изоляция почек или меристем с последующим их культивированием на средах с фитогормонами и индукцией побегообразования.
Преимущество клонального микроразмножения по сравнению с традиционными методами заключается в значительно более высоком коэффициенте размножения. При клональном микроразмножении можно получать до 100 тыс. растений в год, тогда как при обычном размножении - 5-100 растений за тот же срок. Миниатюризация размножения экономит площади, занятые маточными и размножаемыми растениями; в микроразмножении и укоренении участвуют те растения, которые совсем не размножаются или плохо размножаются обычным способом. Очень важно, что клональное микроразмножение часто сопровождается оздоровлением растений. Небольшой эксплант (часть растения, используемая как исходный материал), применяемый для клонального размножения, его поверхностная стерилизация, асептическое (стерильное) культивирование на стерильных питательных средах в условиях, исключающих инфицирование, оздоравливает полученные растения от нематод и бактериальных патогенов. В сочетании с термо- и химиотерапией метод клонального размножения позволяет в значительной степени избавиться и от вирусов, вироидов (инфекционных генов) и микоплазм.
Метод клонального микроразмножения широко используется для получения большого количества посадочного материала у декоративных и овощных культур. Это превосходный способ вегетативного размножения ценных гибридных растений, позволяющий сохранить эффект гетерозиса. В ряде стран, в том числе и в России, существуют промышленные технологические линии по размножению цветочных культур и других растений методами культуры in vitro. В подмосковном колхозе им. В. И. Ленина еще в конце 70-х годов прошлого века было налажено крупномасштабное микроклональное размножение гвоздики элитных сортов, герберы, фрезии. Общее количество получаемых растений составляло более 5 млн штук в год.
В качестве другого примера можно назвать размножение и оздоровление семенного материала картофеля. В России оздоровление картофеля для промышленного семеноводства началось с 1968 г. Уже в 70-х годах были созданы коллекции оздоровленных растений разнообразных сортов картофеля. Самые крупные коллекции поддерживаются в ВИР и в ВНИИСХ. В настоящее время методы оздоровления картофеля значительно усовершенствованы. Применяются методы термо- и химиотерпии для освобождения апикальных меристем от разных вирусов (ВНИИКХ). Метод основан на вычленении апикальных меристем размером 100-200 мкм и регенерации из них in vitro растений.
Значительную модификацию претерпели методы контроля за степенью оздоровления получаемого материала. Кроме использования иммунноферментных методов анализа, разработанных для выявления в клеточном соке конкретных вирусов (разработаны наборы для 12 вирусов), в последнее время предложены более надежные методы ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции (ПЦР). В частности, эти методы используют для диагностики вироидных инфекций. Давно отработана система размножения пробирочных растений картофеля и получения мини-клубней в условиях теплицы. В настоящее время широко внедряются методы получения мини-клубней картофеля в гидропонных установках (фирма «Дока»), а также с использованием «ионитопонной» культуры - на твердых субстратах. В ИФР РАН разработан уникальный метод получения и массового размножения картофеля с использованием биореакторов, обеспечивающих полную стерильность процесса.
В последние годы успешно разрабатываются технологии размножения древесных растений. Так, в Красноярском Институте леса СО РАН ведется работа по сохранению генофонда и воспроизведению уникальных гетерозисных форм сибирских видов хвойных. Комплексный подход, включающий оздоровление, клональное микроразмножение и депонирование посадочного материала при пониженных температурах, используют для поддержания ценных сортов плодовых и ягодных растений в Селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства РАСХН (Москва). До 70% элитного картофеля выращивается с использованием методов оздоровления.
Для практического применения важен также соматический эмбриогенез in vitro. Прямое следствие исследований соматического эмбриогенеза - создание искусственных семян. Показано, что при капсулировании соматических эмбриоидов моркови и апельсина в альгинатный гель они продолжительное время сохраняют высокую жизнеспособность (до 80%) и могут развиваться в полноценные растения.
Соматическая гибридизация. В тех случаях, когда методами традиционной селекции не удается получить гибридные растения, применяют еще одну клеточную биотехнологию - слияние изолированных протопластов. Протопласт представляет собой клетку, лишенную клеточной стенки. Разработан ряд приемов, способствующих слиянию протопластов, выделенных из разных растений. Гибридизацией протопластов можно получить не только межвидовые, но и межродовые гибриды. В отличие от половой гибридизации при слиянии протопластов создаются новые комбинации ядерного и цитоплазматического (митохондриального и пластидного) геномов. Для получения цибридов (растений, гибридных только по цитоплазматическим геномам) у одного из сливающихся протопластов удаляют или инактивируют ядро. Межвидовую соматическую гибридизацию, в частности, используют для переноса генов устойчивости из диких видов в культурные. Например, слиянием протопластов картофеля сорта
Приекульский ранний с протопластами дикого вида Solatium chacoenseb ИФР РАН получен соматический гибрид, имеющий ряд хозяйственно важных признаков. В Белорусском НИИ картофелеводства соматическая гибридизация была успешно использована для переноса признака устойчивости к фитофторозу от дикого мексиканского вида S.bulbocastanum к культурному сорту. Посредством слияния протопластов хлорофиллдефектного мутанта S.tuberosurn и диких соров S.jamesii, S.bulbocastanum, S.carwensy получены растения, в разной степени экспрессирующие признаки названных форм.
Генетическая инженерия. Генетическая инженерия в настоящее время - «модный» раздел растительной биотехнологии. Суть ее состоит в введении нужного гена (генов) - часто их называют «генами интереса» - в растительный организм. «Гены интереса» могут иметь различное происхождение (из бактерий, грибов, животных или даже быть синтетическими) и определять разнообразные свойства: устойчивость растения к биотическим и абиотическим стрессовым факторам, отвечать за синтез ценных белков и др. Вся система создания генетической конструкции, ее введения в организм достаточно сложна. Скажем лишь, что практически всегда для генно-инженерных работ используют объекты in vitro; важнейший фактор, обеспечивающий успех этих работ, - эффективная технология регенерации растений.
Для успешного введения конструкции в геном растений обычно применяют агро-бактериальную трансформацию, т. е. используют системы «природного генного инженера» - патогенной почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Агробактериальная трансформация, однако, эффективна только для двудольных растений, патогеном которых является агробактерия. В настоящее время основные генно-инженерные работы связаны с однодольными растениями, для которых трансформация агробактериаль-ными плазмидами затруднена. В результате комплекса генно-инженерных работ получается трансгенное растение, или трансген - растение-регенерант, в которое введен и эффективно экспрессируется (работает) чужеродный ген (гены).
К настоящему времени в создании трансгенов достигнут значительный прогресс. Например, получены трансгенные растения, несущие гены, определяющие устойчивость к гербицидам, фитопатогенным микроорганизмам, насекомым-вредителям; растения, устойчивые к неблагоприятным условиям внешней среды, имеющие улучшенный внешний вид и пищевые свойства. В мире сейчас получены трансгенные растения более чем 80 сельскохозяйственных культур, среди них важнейшие зерновые культуры (пшеница, рис, кукуруза), овощные (томаты, картофель, сладкий перец), масличные (соя, рапс). Однако большинство из перечисленных трансгенных растений создавались на основе сортов и линий иностранной селекции, не пригодных к выращиванию в агроклиматических условиях России.
Чтобы представить масштабы работ в области создания трансгенных растений, достаточно упомянуть, что к 1998 г. в 45 странах (особенно в США, Канаде и Западной Европе) проведено более 25 тыс. полевых испытаний 60 различных сельскохозяйственных культур. Наиболее часто вводимые новые признаки: устойчивость к гербициду, насекомым, вирусам, грибам, бактериальной инфекции, улучшенные пищевые качества растения. В 1997 г. площадь, занятая под посевами трансгенных селькохозяйственных культур, в мире увеличилась в 4,5 раза по сравнению с 1996 г. Среди основных трансгенных культур следует назвать сою, кукурузу, табак, рапс, хлопчатник, томаты, картофель. Посевные площади под трансгенными растениями в 1998 г. снова увеличились и составили уже более 30 млн га. В качестве примера практического использования генной инженерии в нашей стране можно привести работы с картофелем. В частности, в центре «Биоинженерия» созданы линии, экспрессирующие ген bar (устойчивость к гербициду).
Совместно с БелНИИКХ получены формы, экспрессирующие ген эндотоксина (из бактерии Bacillus thuringiensis), который повышает устойчивость растений к колорадскому жуку. В Институте сельскохозяйственной биотехнологии создана генетическая конструкция на основе гена дифензина редьки (дифензин - белок, обеспечивающий неспецифическую устойчивость к фитопатогенным грибам). С использованием этой конструкции во ВНИИКХ получены трансгенные растения картофеля. В рамках международного проекта (Нидерланды - Венгрия - Белоруссия) созданы трансгенные формы картофеля, экспрессирующие ген, который контролирует синтез лептина. Этот гликоалкалоид синтезируется только в надземной части растения (вид Solanum chacoense) и обеспечивает защиту от колорадского жука.
Не вдаваясь в детали, следует сказать и о потенциальных опасностях широкого внедрения генно-инженерных работ в практическое сельское хозяйство. Дело в том, что трансгенное растение представляет собой новый организм с новыми свойствами. Может случиться, что эти свойства будут вредны для человека (например, при употреблении трансгенного растения в пищу) или экосистемы (например, ген устойчивости к насекомым может передаться многим растениям, что в таком случае приведет к гибели популяции насекомых). Для выяснения безопасности трансгенных растений (кстати, не только растений, но всех генно-модифицированных организмов - ГМО) необходимы длительные многоплановые исследования. Именно длительные, поскольку последствия могут проявиться в поколениях как ГМО, так и использующих их организмов.
Аргументы против подобных испытаний (в частности, «любой гибрид - это тоже генно-модифицированный организм»), как правило, некорректны (гибриды образуются благодаря обмену блоками информации, тогда как встраивание вносимого в хромосому гена не контролируется, что способно нарушить работу генома и что может проявиться не сразу). Вот почему, не отрицая важность и эффективность использования трансгенных организмов в практике, следует признать необходимым строгий контроль за их использованием, тщательное и всестороннее исследование их безопасности и обязательное маркирование всех трансгенных продуктов, поступающих на рынок.
Промышленная биотехнология. В промышленной биотехнологии культура клеток чаще всего используется для получения физиологически активных веществ для медицины, косметики, пищевой промышленности. В настоящее время повышается интерес к лекарствам и продуктам растительного происхождения (фитопрепаратам). Фитопрепараты обеспечивают эффективную профилактику и лечение сердечно-сосудистых, инфекционных, нейродегенеративных, онкологических и других заболеваний. Однако это в целом прогрессивное направление имеет как минимум две отрицательные стороны.
1. Заготовка растительного сырья приводит к сокращению ценных природных растительных ресурсов и даже к исчезновению целых видов растений. Так, лишь для медико-биологических испытаний нового противоопухолевого препарата таксола было уничтожено 12 тыс. взрослых деревьев тиса; практически полностью исчезли в дикорастущем состоянии женьшень, кирказон манчжурский, солодка, золотой и маралий корень и др. Выращивание ценных растений на плантациях часто оказывается нерентабельным.
2. Растения, выросшие в природных условиях или на плантациях, обычно содержат значительное количество токсичных примесей; гербицидов, пестицидов и др.
Культура клеток высших растений - эффективный способ получения растительного сырья для медицины, ветеринарии, парфюмерии, пищевой промышленности. Суть его состоит в получении биомассы культуры клеток растений в стерильных биореакторах большого объема. Преимущества такого использования культур клеток достаточно ощутимы:
• практически абсолютная экологическая чистота процесса выращивания культуры клеток;
• гарантированное получение растительной биомассы с заданными характеристиками независимо от сезона, климатических и погодных условий;
• высокая скорость получения биомассы - до 2 г сухой биомассы с одного литра среды за сутки (для сравнения: прирост корня женьшеня на плантации 1-2 г в год);
• гарантированное отсутствие в биомассе пестицидов, гербицидов, радиоактивных соединений и др;
• возможность использования для получения биомассы стандартного оборудования микробиологических производств (биореакторов, постферментационных систем и др.).
В настоящее время наиболее перспективно использование культур клеток для получения:
противоопухолевых препаратов типа таксола, камптотецина;
антивирусных препаратов, особенно анти-ВИЧ (типа кастаноспермина);
адаптогенных и стимулирующих препаратов как галеновых (из биомассы различных видов женьшеня, полисциаса, родиолы розовой, маральего корня), так и индивидуальных биологически активных веществ растительного происхождения - гинзено-зидов (биологически активных веществ женьшеня);
терпеноидных гликозидов (сапонинов) с широким спектром активности - от подсластителей до иммуностимуляторов.
В ряде случаев биомасса клеток in vitro превосходит по свойствам природное или плантационное растение. Культура клеток незаменима в случае редких, исчезающих или тропических видов лекарственных растений. При таком использовании культур клеток нужно иметь в виду два момента. Получение штамма-продуцента. Далеко не всегда свободноживущие клетки растений in vitro синтезируют нужные вещества в нужном количестве. Это связано с биологическими особенностями культуры клеток как биологической системы: в популяции происходит отбор по интенсивности пролиферации, но не по способности к синтезу ценных для человека веществ. Другими словами, получить в постоянно делящихся клетках растений хороший уровень синтеза «веществ интереса» - сложная задача. К настоящему времени ИФР РАН располагает многими штаммами-продуцентами ценных биологически активных веществ. Среди них штаммы диоскореи дельтовидной - продуценты фуростаноловых гликозидов, стефании голой - продуценты стефарина, серпухи и живучки - продуценты экдистероидов. Уникальный штамм клеток диоскореи дельтовидной в суспензионной культуре продуцирует только фуростаноловые глико-зиды, что обусловливает его преимущества сравнительно с интактным растением (в растении синтезируются спиростаноловые гликозиды с другими свойствами).
В Медицинском радиологическом научном центре РАМН установлено, что препарат фуростаноловых гликозидов «Диофур» из культуры клеток диоскореи обладает выраженными иммуностимулирующими и повышающими неспецифическую резистентность свойствами, в то время как препараты из интактных растений, в которых содержатся в значительном количестве спиростаноловые гликозиды - выраженными иммунодепрес-сивными свойствами. Чрезвычайно важно сохранить штаммы, при этом наиболее эффективный способ - криосохранение. Оптимизация роста штамма и синтеза целевого продукта. Для многих штаммов оптимизировано культивирование и разработана технология выращивания в биореакторах с максимальным объемом до 630 л. В АО «ТЭМБР» (Ярославль) выращивают суспензии женьшеня в проточном режиме в биореакторе объемом 7500 л. Некоторые разработки уже имеют промышленное применение. Первое в мире промышленное производство биомассы культур клеток осуществлено в России.
Еще в конце 70-х гг. XIX в. на ряде заводов Главмикробиопрома было организовано производство биомассы культуры клеток женьшеня. На ее основе созданы медицинские препараты (настойка «Биоженьшень») и косметические средства (шампунь «Диона», лосьон «Женьшеневый» и др.). В настоящее время из культуры клеток полисциаса производится нутрицевтик (пищевая добавка) «Витагмал». Установлены адапто-генные и антистрессовые свойства названного препарата. Особенно он эффективен для пренатальной (дородовой) безопасности и при постинфарктных состояниях. На завершающей стадии находится разработка препарата фуростаноловых гликозидов «Диофур» («Дельтастим»). За рубежом известны несколько примеров получения лекарственных препаратов на основе культур клеток высших растений. Впервые производство суспензионной культуры клеток воробейника осуществлено в Японии, где получают из этой культуры нафтохинон шиконин. Очень важный пример - получение противоопухолевого препарата таксола на основе культуры клеток тисса (Taxus sp.), предпринятое фирмой Fyton (США - Германия).