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Comunicación

Identificación y caracterización de especies de Neosartorya aisladas de frutillas (Fragaria spp.) frescas y tratadas térmicamente

Identification and characterization of Neosartorya species isolated from fresh and thermally treated strawberries (Fragaria spp.)

Laura Frisón¹*, Silvina Sobrero², Juan De Jesús¹, María de Basílico¹, Juan Basílico¹

¹Cátedra de Microbiología, Departamento de Ingeniería en Alimentos, Facultad de Ingeniería Química, Universidad Nacional del Litoral. Santiago del Estero 2829 (3000), Santa Fe, Argentina.

²Química General, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral. Ciudad Universitaria (3000), Santa Fe, Argentina.

*Autora para correspondencia: lfrison@fiq.unl.edu.ar

Aceptado 23-Diciembre-2012

Resumen

El género Aspergillus es uno de los géneros fúngicos más estudiados y de gran impacto a nivel industrial. La sección Fumigati incluye unas pocas especies anamorfas del género Aspergillus. Las especies que son teleomorfas se encuentran dentro del género Neosartorya. Este es un moho resistente al calor que causan problemas en las industrias alimentarias o enfermedades en los seres humanos. Sus ascosporas han sido aisladas a partir de frutas, pulpas y jugos, ya que pueden sobrevivir a los tratamientos de térmicos industriales pudiendo aparecer la contaminación post-pasteurización. El objetivo fue caracterizar aislados de Neosartorya de frutillas frescas recién cosechadas y tratadas térmicamente, analizando la ornamentación de las ascosporas, toxicidad y resistencia térmica. Se aislaron las colonias, y se identificaron macro y microscópicamente siguiendo la metodología de Pitt y Hocking (2009), de 60 muestras. Se caracterizaron las ascosporas por microscopía electrónica de barrido. Se determinó la capacidad toxicogénica de los extractos por cromatografía líquida de alta eficiencia. Se evaluó la resistencia térmica a diferentes temperaturas. Se aislaron 18 cepas de Neosartorya de frutillas recién cosechadas, y otros mohos termorresistentes como Arthrinium phaeospermum, Byssochlamys nivea y Talaromyces macrosporus. En las frutillas tratadas térmicamente no se aislaron mohos termorresistentes. Trece aislados mostraron ascosporascoincidentes con N. fischeri, el resto con N. spinosa. Los aislados de N. fischeri produjeron fumitremorgina A y B y verruculógeno en arroz, pero no lo hicieron en frutillas frescas. Los parámetros de resistencia térmica fueron: D_{80 ºC}: 20 - 22 minutos, D_{85 ºC}: 9 - 11 minutos, D_{90 ºC}: 2 - 3 minutos y z: 10 - 11 ºC para N. fischeri y D_{80 ºC}: > 120 minutos, D_{85 ºC}: 11 - 94 minutos, D_{90 ºC}: 3 - 15 minutos y z: 6 - 9 ºC para N. spinosa. Es indispensable aplicar buenas prácticas agrícolas y buenas prácticas de manufactura porque es muy difícil su eliminación o control.

Palabras claves: frutillas o fresas, morfología, Neosartorya, resistencia térmica, toxicidad.

Abstract

The genus Aspergillus is one of the most studied fungal genera and has great impact in industry. Fumigati section includes a few species of the genus Aspergillus anamorphs. Teleomorphs species are found within the genus Neosartorya. This is a heat-resistant mold that cause problems in food industries or cause disease in humans. Their ascospores have been isolated from fruit pulps and juices as they can survive the industrial thermal treatments can appear post-pasteurization contamination. The purpose was to characterize Neosartorya isolates from fresh strawberries and heat treated, analyzing the ornamentation of ascospores, toxicity and heat resistance. The colonies were isolated, and identified macro and microscopically following the methodology of Pitt and Hocking (2009), from 60 samples. Ascospores were characterized by scanning electron microscopy. The toxicogenic capacity of extracts was assessed by high performance liquid chromatography. The thermal resistance at different temperatures was evaluated. Neosartorya (18 strains) were isolated from freshly harvested strawberries and other molds resistant: Arthrinium phaeospermum, Byssochlamys nivea and Talaromyces macrosporus. Heat-resistant molds from thermally treated strawberry were not isolated. Thirteen isolates showed ascospores coincident with N. fischeri, the rest with N. spinosa. The isolates of N. fischeri produced fumitremorgin A and B and verruculogen in rice, but did not produce in fresh strawberries. Thermal resistance parameters were: D_{80 ºC}: 20 - 22 minutes, D_{85 ºC}: 9 - 11 minutes, D_{90 ºC}: 2 - 3 minutes and z: 10 - 11 ºC for N. fischeri and D_{80 ºC}: > 120 minutes, D_{85 ºC}: 11 - 94 minutes, D_{90 ºC}: 3 - 15 minutes and z: 6 - 9 ºC for N. spinosa. It is essential to follow good agricultural practices and good manufacturing practices because it is very difficult to remove or control.

Keywords: morphology, Neosartorya, strawberries, thermal resistance, toxicity.

INTRODUCCIÓN

El género Aspergillus es uno de los géneros fúngicos más estudiados y de gran impacto a nivel industrial. La sección Fumigati incluye unas pocas especies anamorfas del género Aspergillus; las especies que son teleomorfas se encuentran dentro del género Neosartorya (Brakhage y Langfelder, 2002; Samson et al., 2007). Esta sección incluye en la actualidad 26 especies, varias de ellas han sido descriptas como agentes causantes de enfermedades en humanos tales como: aspergilosis invasiva, osteomielitis, endocarditis y queratitis micótica, o bien como productoras de micotoxinas que representan un serio peligro latente para la salud humana (Pitt et al., 2000; Samson, 2000; Horie et al., 2003; Järv et al., 2004; Balajee et al., 2005; 2006; Hong et al., 2005; 2006; Larsen et al., 2007; Samson et al., 2007; Vinh et al., 2009; Serrano et al., 2011).

Todas las especies de Neosartorya producen ascosporas resistentes al calor por lo que es frecuente encontrarlas en diferentes productos alimenticios tratados térmicamente como jugos de frutos y otros productos a base de frutos procesados por calor, ya que pueden sobrevivir a los tratamientos de pasteurización aplicados industrialmente. En estos procesos se eliminan los microorganismos competidores y se activan las ascosporas pudiendo aparecer la contaminación post-pasteurización (Rajashekhara et al., 1998; Sobrero et al., 2002; Samson et al., 2007; Yaguchi et al., 2012).

La ornamentación de las ascosporas es una importante característica morfológica para distinguir las diferentes especies. N. fischeri, N. glabra y N. spinosa pueden ser separadas teniendo en cuenta esta ornamentación, el perfil de micotoxinas y los parámetros de resistencia térmica (Kozakiewicz, 1989; Samson et al., 1990; 1992; Nielsen, 1991; Horie et al., 2003). N. glabra y N. spinosa son las variedades más termorresistentes, mientras que N. fischeri es la especie productora de toxinas tremorgénicas. Estas son neurotoxinas que en bajas dosis producen temblores en animales por largos períodos de tiempo, pero cuando se incrementa la dosis pueden ser letales para los mismos. N. fischeri produce fumitremorgina A, B y C y verruculógeno (Cole et al., 1972; Liu et al., 1996; Khoufache et al., 2007; Salomão et al., 2008).

Por otra parte, la frutilla (Fragaria spp.) es una planta de la familia Rosaceae. Lo que se conoce como frutilla o fresa, es un receptáculo floral engrosado sobre el que se encuentran incrustados, en su superficie, los verdaderos frutos (aquenios). Botánicamente, la frutilla es un eterio (Navarro-Aranda y Muñoz-Garmendia, 1998; Lavín-A. y Maureira-C., 2002). El principal componente, después del agua lo constituyen los hidratos de carbono (con una cantidad moderada alrededor del 5 % de su peso), fundamentalmente fructosa y glucosa. Son muy ricas en vitamina C (con un porcentaje superior, en ocasiones, al que posee la naranja) y ácido fólico. Entre los minerales se destacan el hierro, yodo y calcio, además del fósforo, magnesio y potasio. Son buena fuente de fibra. Contienen diversos ácidos orgánicos, entre los que destacan el ácido cítrico, málico, oxálico y también contienen pequeñas cantidades de ácido salicílico. La capacidad antioxidante, no sólo se debe a su contenido en antocianinas, sino a la presencia en su composición de cantidades importante de polifenoles (ácido elágico) y de vitamina C (Murcia et al., 2001; Sun et al., 2002; Koyunku y Dilmaçünal, 2010; Carvajal de Pabón et al., 2012). Debido a todas estas propiedades, el consumo de frutillas como producto fresco o procesado como confitura, mermelada, helado, yogurt se ha incrementado notablemente.

En Argentina se producen 30.000 t anuales de frutillas en un área de 1.000 a 1.150 ha, de las cuales el 30 % corresponde a Coronda (Provincia de Santa Fe), 40 % a la Provincia de Tucumán y el resto a otras zonas productoras como Corrientes (6 %), Buenos Aires (15 %), Mendoza (1 %) y provincias del sur del país (8 %). La región de Coronda (Departamento San Jerónimo, Santa Fe) concentra el 30 % de la superficie sembrada del cultivo (Sordo, 2012) y además de Coronda se produce en los distritos Desvío Arijón y Arocena. La producción regional tiene gran importancia por su historia, ubicación geográfica y especialización. Las características propias de la región (suelo arenoso, clima benigno y calidad de agua de riego) han proporcionado factores determinantes del buen desarrollo de las plantas.

Teniendo en cuenta los inconvenientes que la presencia de Neosartorya puede ocasionar a la industria, se propuso identificar y caracterizar las especies aisladas de frutillas frescas y tratadas térmicamente que se utilizan para agregar a yogurt, helado u otros productos de pastelería, analizando la ornamentación de las ascosporas, la toxicidad y la resistencia térmica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras

Las muestras de frutillas (Fragaria vesca) frescas fueron cosechadas a granel de una plantación comercial de la zona de Coronda (Santa Fe, Argentina); las frutillas enteras tratadas térmicamente (producto enlatado) para adicionar a helados y productos de pastelería, procedían de una empresa de la misma zona. Las frutillas para agregar a yogurt se tomaron de góndolas de supermercados de la ciudad de Santa Fe. Se procesaron 60 muestras en total (20 de frutillas frescas, 20 de frutillas enteras enlatadas tratadas térmicamente y 20 de frutillas tratadas térmicamente para agregar a yogurt).

Aislamiento

Las frutillas frescas fueron lavadas con agua estéril, se retiraron los cabos y sépalos en condiciones de esterilidad. Estas muestras, y las comerciales, se colocaron en bolsas estériles, se trituraron y homogeneizaron en un Stomacher 400 Lab Blender (Seward Medical, London, UK) hasta obtener una pulpa. Las pulpas se sometieron a un tratamiento térmico de 80 ºC durante 15 minutos en un baño termostático marca Dalvo, modelo BMK (Tecno Dalvo, Santa Fe, Argentina) para eliminar los mohos no termorresistentes y activar las ascosporas. Se enfrió en un equipo de baño maría, marca ICSA, modelo BMS2G (Instrumentación Científica, S. A., Buenos Aires, Argentina) y se mezcló en proporción 1:1 con los medios de cultivo preparados con doble concentración. Los medios utilizados fueron: Agar Extracto de Malta (MEA), Agar Papa Dextrosa (PDA), ambos con agregado de cloranfenicol (100 mg/L) y Diclorán Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC). Se incubó en estufa durante 30 días a 28 ºC. Los medios MEA y PDA fueron elegidos por estar recomendados dentro del protocolo especial para mohos resistentes al calor (Hocking y Pitt, 1992; Pitt y Hocking, 2009).

Purificación, identificación y conservación

Los aislados se sembraron en placas con medio MEA incubando a 28 ºC por 7 días. Las colonias de Neosartorya aisladas se identificaron macro y microscópicamente, siguiendo la metodología de Pitt y Hocking (2009). Para caracterizar las formas y superficies de las ascosporas se realizó microscopía electrónica de barrido (SEM, ‘Scanning Electron Microscope’). Los aislados se incubaron en Agar Czapek (ACZ), a 25 ºC durante 21 días (Kozakiewicz, 1989). Las muestras se recubrieron con oro en un equipo SPI Module^TM Sputter, SPI 12157-AX (SPI® Supplies/Structure Probe, Inc., West Chester, PA, USA), operado bajo una atmósfera de argón. Se observaron con un microscopio electrónico de barrido, marca JEOL, modelo JSM-6400 (JEOL, Ltd., Tokyo, Japón). Las fotografías se tomaron bajo la apariencia de imágenes de electrones secundarios con un voltaje de aceleración de 15 kV, y aumento a 8000X. Finalmente, con todos los datos, se comparó morfológicamente con las claves publicadas por Horie et al. (2003), Samson et al. (2007) y Hong et al. (2008).

Los diferentes aislados ya identificados se conservaron en viales con agar agua (0,2 % m/v) por raspado de las ascosporas de las superficies de la placa de MEA y guardaron a 5 ºC hasta su uso.

Determinación de la capacidad toxicogénica

Se sembró cada aislado de Neosartorya en arroz integral estéril con 25 % de humedad y se cultivó durante 1 mes a 28 ºC (Liu et al., 1996). Las toxinas se extrajeron con cloroformo. Los extractos se filtraron y concentraron al 50 %, en rotavapor marca BÜCHI, modelo RE 111 (BÜCHI Labortechnik AG, Suiza), a 70 ºC. Se realizó un ‘screening’ por Cromatografía en Capa Delgada (TLC, ‘Thin Layer Chromatography’) según Cole y Cox (1981), para evaluar la presencia de fumitremorgina A (FTA), fumitremorgina B (FTB) y verruculógeno (VC).

Los resultados positivos se confirmaron por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC, ‘High Performance Liquid Chromatography’). Se utilizó un cromatógrafo líquido KONIK® 500 (KONIK-Tech, Barcelona, España), equipado con una columna Phenomenex® RP C18 ODS (250 x 4,6 mm) (Phenomenex, Inc., Torrance, CA, USA) con detector KONIK® UV-Vis 200 (KONIK-Tech, España) y con un integrador Spectra-Physics (Spectra-Physics, Inc., San Jose, CA, USA) (Samson et al., 1992). Las condiciones fueron: para FTA el tiempo de retención del estándar fue 14,56 minutos y para la muestra de 14,53 minutos. La fase móvil acetonitrilo-agua (gradiente de 15 % a 90 % en 15 min.), caudal 1,0 mL/minutos, longitud de onda 235 nm. Para FTB el tiempo de retención del estándar fue de 8 minutos y para la muestra de 7,97 minutos. La fase móvil y condiciones de corrida fueron similares a la de FTA pero la longitud de onda de 230 nm. Para VC el tiempo de retención del estándar fue de 5,06 minutos y para la muestra de 5,12 minutos. La fase móvil fue acetonitrilo-agua (15:85), caudal 0,8 mL/minutos, longitud de onda 254 nm. En todos los casos la velocidad de la carta fue de 0,25 cm/min y la atenuación de 128.

Resistencia térmica de las ascosporas

Se siguió la metodología propuesta por Nielsen y Samson (1992). Se prepararon suspensiones de 106 ascosporas/mL y se inocularon en jugo de manzana estéril. Luego se calentaron a 80, 85 y 90 ºC por diferentes espacios de tiempo, enfriando inmediatamente en baño de hielo. Se realizaron diluciones en agua de peptona estéril (0,1 % m/v) que se sembraron en medio Agar Extracto de Levadura Czapek (CYA) de pH 3,5 enriquecido con sacarosa 10 % m/v y Rosa de Bengala 20 mg/L. Las placas se incubaron durante 7 días a 28 ºC. Luego de realizar el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) se procedió a calcular los parámetros D o tiempo de reducción decimal (minutos) y z o constante de resistencia térmica (ºC), que caracterizan la destrucción de las ascosporas por el calor. En todos los casos se realizaron 5 repeticiones. El parámetro D se calculó graficando el log N vs t (Ec.1).

Donde: N₀ es la concentración inicial de microorganismos y N_t es la concentración final de microorganismos. El parámetro z se calculó graficando el log D vs T (Ec. 2).

Donde D₁ y D₂ son los tiempos de reducción decimal a las temperaturas T₁ y T₂.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislados e identificación

Se aislaron 18 cepas de Neosartorya de frutillas naturales recién cosechadas. De los medios utilizados (MEA, PDA, DRBC); en el medio MEA se obtuvo el mayor porcentaje de recuperación (50 %). Otros mohos termorresistentes que se identificaron fueron: Arthrinium phaeospermum, Byssochlamys nivea y Talaromyces macrosporus. Estos resultados coinciden con los citados en la literatura para frutos, pulpa de frutos y jugos (Splittstoesser, 1991; Samson et al., 1992; Tournas, 1994; Beuchat y Pitt, 2001; Javoreková et al., 2009).

En las frutillas comerciales no se aislaron mohos termorresistentes. Esto indicaría que los tratamientos utilizados, combinado con la adición de sorbato de potasio como conservante resultarían adecuados o bien que las mismas no estaban inicialmente contaminadas, o que los procesos de selección y lavado fueron eficientes.

Trece aislados presentaron en SEM ascosporascon superficies convexas y 2 crestas anastomosadas. N. fischeri, N. tatenoi y N. hiratsukae presentan estas características. Su diferenciación es compleja, en que en la primera las ascosporas presentan un reticulado irregular o débilmente reticulado, la segunda un microreticulado regular con vesículas semiesféricas en forma de botella y la tercera un reticulado fino (Yaguchi et al., 1994; Varga et al., 2000; Horie et al., 2003; Hong et al., 2010). El resto de los aislados mostraron ascosporas con 2 crestas ecuatoriales bien separadas y sobre las 2 superficies convexas se pueden ver proyecciones con forma de espinas (Fig. 1). Estas mismas características se observan en N. spinosa, N. coreana y N. laciniosa (Horie et al., 2003; Hong et al., 2006; 2008; 2010).

Capacidad toxicogénica

Los aislados coincidentes con las característica de Neosartorya fischeri o N. tatenoi o N. hiratsukae al someterlos al método de ‘screening’ para detectar FTA, FTB y VC resultaron positivos; se confirmaron por HPLC. Se pudo comprobar que todos los aislados mostraron capacidad de producir al menos una de las toxinas. Se obtuvieron 46,1 % de cepas productoras solo de FTA; 15,4 % solo de FTB o VC. Una sola cepa produjo VC + FTB (7,6 %); no hubo producción de VC + FTA, ni producción de FTA + FTB conjuntamente. El 15,4 % restante generó las 3 toxinas simultáneamente. Las cepas productoras de toxinas tremorgénicas se identificaron como N. fischeri. Se repitió el ensayo reemplazando al arroz integral por frutillas frescas estériles. Se comprobó que el moho creció muy bien sobre las frutillas frescas, pero no produjo FTA, FTB, ni VC en este sustrato.

Resistencia térmica

Los 5 aislados restantes se estudiaron desde el punto de vista de la resistencia térmica, ya que información en la literatura muestra lo resistentes al calor que son las ascosporas de N. spinosa y los problemas tecnológicos que ellas podrían causar (Beuchat, 1986; Nielsen y Samson, 1992; Yaguchi et al., 2012).

Los valores promedios encontrados para el tratamiento térmico de las ascosporas en jugo de manzana para N. fischeri fueron D_{80 ºC}: 20 - 22 minutos, D_{85 ºC}: 9 - 11 minutos y D_{90 ºC}: 2 - 3 minutos. El valor D_{90 ºC} coincidió con el indicado para N. fischeri IMI 16143 por Samson et al. (1992) y el publicado por Salomão et al. (2007). Con respecto al valor z, el hallado fue 10 - 11 ºC, igual que para N. fischeri IMI 16143 (Samson et al., 1992), mientras que el valor publicado por Salomão et al. (2007) fue 5 ºC. El valor de D_{90 ºC}: 2 - 3 minutos, mostró que es menos resistente al calor que N. spinosa (D_{90 ºC}: 3 - 15 minutos). Los resultados de resistencia térmica para las 5 cepas restantes se muestran en el Cuadro 1.

Estos datos son comparables con datos bibliográficos correspondientes a N. spinosa H37 (D_{80 ºC}: > 120 minutos, D_{85 ºC}: 96 minutos, D_{90 ºC}: 9 minutos, z: 5 ºC), FRR 2334 (D_{80 ºC}: > 120 minutos, D_{85 ºC}: 21 minutos, D_{90 ºC}: 4 minutos, z: 6 ºC), CBS 483.65 (D_{80 ºC}: > 120 minutos, D_{85 ºC}: 11 minutos, D_{90 ºC}: 5 minutos, z: 7 ºC), IBT 3001 (D_{80 ºC}: > 120 minutos, D_{85 ºC}: 10 minutos, D_{90 ºC}: 3 minutos, z: 6 ºC) (Nielsen y Samson, 1992). No se conocen datos de resistencia térmica para N. coreana y N. laciniosa.

Al realizar el estudio utilizando como medio de calentamiento pulpa de frutilla estéril sin conservante, se encontró que 15 minutos a 90 ºC no fueron suficientes para eliminar a N. spinosa. Otros autores realizaron ensayos de muerte térmica en jugos de frutos como manzana, ananá o piña, papaya o lechosa, (Salomão et al., 2007), pulpa de tomate (Baglioni et al., 1999), jugos cítricos de naranja, limón, pomelo, mandarina (Sobrero et al., 2002; Amaeze, 2012), encontrando también valores elevados de termorresistencia que ocasionarían un problema en la industria.

El aislado Nº 16 presentó un D_{90 ºC}: 15 minutos, que coincide con el ‘holding’ del proceso utilizado en las plantas procesadoras de la región. Por esto, es necesario que cada empresa identifique los mohos termorresistentes presentes en su materia prima para definir el proceso de calentamiento adecuado ya que si estas ascosporas están presentes, el calentamiento actuaría como choque térmico activándolas (Slongo y de Aragão, 2006; Amaeze y Ugwuanyi, 2011).

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Se demostró la presencia de N. fischeri y N. spinosa en frutillas frescas cosechadas a granel en la zona de Coronda, Argentina.

En las frutillas comerciales tratadas térmicamente no se aislaron mohos termorresistentes.

N. fischeri posee la capacidad para producir FTA, FTB y VC en condiciones de laboratorio, sembrada en arroz integral estéril con 25 % de humedad. No se detectó la producción de estas toxinas cuando los aislados toxicogénicos se sembraron en frutillas estériles.

Un aislado de N. spinosa presentó tiempo de reducción decimal D_{90 ºC}: 15 minutos, coincidente con el ‘holding’ del proceso utilizado en las plantas procesadoras de la región. Por esto, es necesario que cada empresa identifique los mohos termorresistentes presentes en su materia prima para definir el proceso de calentamiento adecuado ya que si estas ascosporas están presentes, el calentamiento actuaría como choque térmico activándolas.

La incorporación de frutillas contaminadas a productos lácteos y de pastelería podría dar lugar en estas nuevas condiciones de sustrato, a que este moho pueda crecer con el consecuente riesgo toxicológico; por lo que se deberían continuar los estudios en estos alimentos.

Es indispensable aplicar buenas prácticas agrícolas y buenas prácticas de manufacturas ya que una vez que las frutillas se contaminan es muy difícil su eliminación o control.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Dr. J. Guarro y al Servicio de Microscopía Electrónica de la Unidad de Microbiología de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universitat Rovira i Virgili, Reus, España por haber permitido que la Dra. María Z. de Basílico, en colaboración con su personal, tomara las microfotografías electrónicas.

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