ISOLAMENTO BATTERI DALLA RIZOSFERA MARINA

Preparazione del campione e isolamento

1. Unire 1 g di sedimento radicale + 9 ml di acqua di mare.

2. Porre in agitazione con vortex per 1 ora per favorire la precipitazione di agenti chimico-fisici indesiderati.

3. Fare diluizioni seriali fino a 10⁻⁶ in acqua di mare.

4. Piastrare 100ul di ogni diluizione in piastre di

• Marine Broth + 3.5% NaCl + Nystatin: Inoculo di 100 µl per ogni diluizione.

5.Incubare 20°C per 20 giorni e osservare a intervalli di tempo (24, 48h etc etc)

CARATTERIZZAZIONE MORFOLOGICA

Osservazione diretta

1. Analizzare le colonie batteriche allo stereoscopio.

Allestimento preparati a fresco

1. Porre su un vetrino portaoggetti una goccia d’acqua.

2. Coprire la goccia con un vetrino coprioggetti ed osservare al microscopio

Colorazione di Gram

1. Deporre con un’ansa sterile monouso una colonia singola da analizzare in una goccia posta su vetrino. Stemperare e lasciare asciugare

2. Fissare batteri al calore

3. Aggiungere una goccia di cristalvioletto e incubare per 1 min.

4. Lavare con acqua distillata e asciugare

5. Trasferire una goccia di reattivo di Lugol sui batteri e incubare per 1 min.

6. Lavare con acqua distillata e asciugare

7. Aggiungere una goccia di Safranina per circa 1 min.

8. Lavare con acqua ed asciugare

9. Osservare i preparati al microscopio ottico.

Saggio sporulazione

1. Strisciare una colonia singola di ciascun ceppo su piastra DSM (terreno minimo).

2. Far crescere in incubatore statico a 37°C per almeno 40 h.

3. Analizzare le spore al microscopio

DSM (Difco sporulation medium):

fino A 1L di H2O distillata

• 8 g di Bacto-nutrient broth 1 g KCl

• 0.12 g di MgSO4

• 0.5 ml di NaOH 1 M

Marine Broth

Utilizzato per la crescita di batteri marini o alofili (che richiedono alte concentrazioni di sale). La composizione standard (per 1 litro) è:

• Peptone (proteine digerite): 5 g

• Estratto di lievito (Yeast Extract): 1 g

• Ferro citrato: 0.1 g

• NaCl (cloruro di sodio): 19.45 g

• MgCl₂ (cloruro di magnesio): 8.8 g

• Na₂SO₄ (solfato di sodio): 3.24 g

• CaCl₂ (cloruro di calcio): 1.8 g

• KCl (cloruro di potassio): 0.55 g

• NaHCO₃ (bicarbonato di sodio): 0.16 g

• KBr (bromuro di potassio): 0.08 g

• SrCl₂ (cloruro di stronzio): 0.034 g

• Acqua distillata: fino a 1 L

pH: 7.6 ± 0.2 (regolato con NaOH/HCl)

CURVA DI CRESCITA BATTERICA

1. Inoculare una singola colonia di ciascun ceppo in 50 ml di terreno LB

2. Valutare la crescita batterica mediante densità ottica (OD) a 600 nm a 5 e 15 giorni.

Concentrazioni di NaCl impiegate

NaCl 30% -35% (5,0M)- simile all’acqua di mare

Diluizioni per alofili moderati e estremi)

• NaCl 15% (2,6 M)

• NaCl 20% (3,4 M)

• NaCl 24% (4,0 M)

Per 1L di terreno LB:

• 10 g di triptone, 

• 5 g di estratto di lievito 

• 10 g di NaCl 

• Aggiustare il pH a 7.0 aggiungendo goccia a goccia una soluzione 5N di NaOH.

Solubilizzazione del fosforo

1. Inoculare i ceppi in 2 mL di LB per 4-5 h in agitazione a 37°C fino alla fase esponenziale

2. Trasferire 4 µl dell’inoculo al centro di piastre (spot) con terreno selettivo (PVK, con fonte di fosforo) e lasciare crescere le colonie

3. Analizzare l’efficienza di solubilizzazione dei ceppi misurando il diametro dell’alone chiaro formatosi sulla piastra intorno alla colonia stessa,

Swarming test

1. Inoculare singola colonia in 2 mL di terreno ricco LB per 4-5 h in agitazione a 37°C, fino alla fase esponenziale

2. Trasferire 4 µL dell’inoculo su piastre (terreno LB Agar molle, 0,7% agar), per poter permettere la motilità batterica su piastra.

3. Confrontare tra di loro le colonie a occhio nudo

Produzione ammoniaca

1. Coltivare i batteri in peptone con diverse concentrazioni di NaCl (0, 150, 200 e 400 mM) per 72 ore a 28°C con agitazione.

2. Aggiungere 1 ml di reagente di Nessler a 1 ml di surnatante di ciascun batterio e portare a 10 ml con acqua distillata priva di ammoniaca.

3. La variazione del colore da marrone a giallo è indice di produzione di ammoniaca.

Produzione IAA

1. Coltivare i batteri come sopra

2. Aggiungere 2 ml di reagente di Salkowski (2% 0,5 FeCl3 in soluzione al 35% di HClO4) e tenere al buio per 30 minuti.

3. Misurare la densità ottica (OD) a 530 nm.

Formazione biofilm

1. Coltivare i ceppi batterici in piastre di coltura a 24 pozzetti in brodo LB con diverse concentrazioni di NaCl (0, 150, 200 e 400 mM) per 48 ore senza agitazione a 37°C.

2. Eliminare surnatante e lavare con acqua distillata.

3. Aggiungere 1 mL di soluzione di cristalvioletto (CV) allo 0,1% per colorare la biomassa aderente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

4. Aggiungere 1 mL di etanolo al 70% a ciascuna provetta per far rilasciare il colorante CV legato al biofilm

5. quantificare ad un'assorbanza di 570 nm (O’Toole, 2010).

Piastre PVK

Ingredienti Grammi/Litro

Estratto di lievito 0,5

Destrosio 10,0

Fosfato di calcio 5,0

Solfato di ammonio 0,5

Cloruro di potassio 0,2

Solfato di magnesio 0,1

Solfato di manganese 0,0001

Solfato ferroso 0,0001

Agar 15,0

Estrazione DNA (con kit Extraclean)

·       Aggiungere il campione (colonia) a una provetta contenente 100 µl di soluzione Extraclear per l'estrazione.

·       Agitare la provetta contenente il campione e la soluzione di estrazione del DNA per 15 sec. Assicurarsi che il campione sia completamente coperto dalla soluzione Extraclear.

·       Trasferire la provetta in un termociclatore e incubare per :

-        65 °C per 6 min

-        98 °C per 2 min

-         4 °C (o raffreddare su ghiaccio)

-        Utilizzare l’estratto per la PCR.

(Gli estratti di DNA possono essere conservati a -20 °C per una settimana o per molto tempo a -80 °C)

Amplificazione regione IGS

Primers per regione 16S-23S: 

FGPS1490 TGCGGCTGGATCACCTCCTT

FGPS1329 CCGGGTTTCCCCATTCGG

Condizioni di PCR

95°C for 3 min 30 s

30 cycles

·       93.5°C for 1 min

·       55°C for 40 s

·       72°C for 1 min

72°C for 5 min

Analisi polimorfismi per lunghezza dopo caricamento su gel di agarosio (1-1.5%) in tampone TAE:

lunghezza dei frammenti aspettata: 300-1500 bp

Elettroforesi

Analisi polimorfismi per lunghezza sequenza intergenica dopo caricamento su gel di agarosio (1-1.5%) in tampone TAE comn marker 100bp ladder:

lunghezza dei frammenti aspettata: 300-1000 bp

Esempio: 

Pseudomonas spp. → 300-700 bp 

Bacillus spp. → 500-1200 bp 

Rhizobium spp. → 350-900 bp

Digestione

Enzimi utilizzati: Hae III (GGCC) Msp l (CCGG)  Alu I (AGCT)

Temperatura: 37°C

Tempo di incubazione: 1 ora

Inattivazione: 65C x 20 min

Gel: Agarosio 2-3% in TAE

CONTROLLI:

DNA non digerito (verifica integrità).

Mix senza enzima (controllo negativo).

DNA con siti noti (controllo positivo )

HaeIII (GGCC)

Spesso discrimina tra Pseudomonas e Bacillus.

In Pseudomonas, può dare 2-4 frammenti di 50-400 bp.

In Bacillus, può dare 3-5 frammenti, alcuni di dimensioni maggiori (>500 bp).

MspI (CCGG)

Separa efficacemente i gruppi di rizobatteri Gram-negativi.

In Pseudomonas, possono apparire 3-6 frammenti di 100-600 bp.

In Bacillus, il taglio può essere meno frequente → bande più grandi e meno numerose.

AluI (AGCT)

Enzima con molti siti di restrizione → produce frammenti più piccoli rispetto agli altri due.

Può dare 4-8 frammenti tra 50-300 bp a seconda della specie e può aiutare a distinguere Rhizobium e altri rizobatteri.

Elettroforesi

Analisi polimorfisimi per lunghezza frammenti di digestione dopo caricamento su gel di agarosio (2.5%) in tampone TAE con marker 50bp ladder:

lunghezza dei frammenti aspettata: 50-600 bp

Screening resistenza alla salinità della germinazione dei semi

1. Sterilizzazione semi con lavaggio di 30’’ in 70%, EtOH lavaggio di 10’ 1%, NaClO risciacqui in acqua sterile per 10’ e asciugatura su carta sterile.

2. Germinazione in piastra su terreni MS con il 20% di saccarosio a diverse concentrazioni saline (0, 20, 50, 70, 100 mM NaCl)

3. Conteggio, in percentuale, dei semi germinati sul totale dei semi utilizzati

Condizioni camera: 25 ± 1 °C, umidità relativa del 40%, cicli luce/buio 16 h/8 h per 15g

Preparazione biofertilizzanti

1. Crescita batteri, per una notte, in terreno LB a 37 ± 2 °C; e quantizzazione mediante Camera di Bürker e al microscopio ottico.

2. Centrifugazione a 5000 × g per 15’ e lavaggio con tampone fosfato (pH 7,0)

3. Preparazione aliquote delle sospensioni batteriche ( 1x10 ^8 CFU mL -1 )

Saggio di immersione a diverse concentrazioni saline

1. Raccolta dei germogli dalle piastre con concentrazione più elevata di NaCl e immersione nella coltura batterica (1x10 ^8 CFU mL -1) risospesa in 10 ml di 1X PBS, in condizioni di sterilità.

2. Posizionamento germogli su piastre Petri con terreno MS arricchito e integrato con le diverse concentrazioni di NaCl (20, 50, 70 e 100Mm),.

Condizioni di crescita come quelle di germinazione ma per 30g in piccola serra

Valutazione dei parametri fisiologici delle piante.

1. Misurazioni, con un righello di riferimento, della lunghezza delle radici primarie, dell'area fogliare, della lunghezza delle foglie e del diametro di queste ultime.

2. Misurazione del peso fresco con una bilancia digitale.

Terreno di germinazione e propagazione:

terreno MS (Murashige and Skoog, 1962)

• saccarosio 30 gL-1

• agar 8 gL-1

• vitamine: acido nicotinico 1 mgL-1, piridossina 1 mgL-1, tiamina 10 mgL-1,inositolo 100 mgL-1, pH 5.6

REGOLE DI SICUREZZA 

1. Consultazione delle Schede di Sicurezza (SDS)

   • Consultare le SDS di tutte le sostanze chimiche e i reagenti utilizzati.

   • Adottare misure adeguate per manipolazione, stoccaggio e smaltimento.

   • Preferire reagenti meno tossici e a basse concentrazioni, se possibile.

2. Dispositivi di Protezione Individuale (DPI)

   • Utilizzare i DPI prescritti (es. camice, guanti, occhiali di protezione, mascherina).

   • Assicurarsi che i DPI siano indossati e rimossi correttamente.

3. Dispositivi di Protezione Collettiva (DPC)

   • Verificare il funzionamento di cappe di sicurezza e docce di sicurezza

   • Garantire che i DPC siano sottoposti a manutenzione regolare.

4. Disinfezione delle superfici

   • Disinfettare le superfici di lavoro prima e dopo l’uso con prodotti appropriati.

   • In caso di fuoriuscite, procedere immediatamente alla disinfezione.

5. Livello di Biosicurezza (BSL-1)

   • I batteri utilizzati sono a basso rischio (BSL-1).

   • Mantenere pratiche e attrezzature conformi alle linee guida BSL-1.

6. Smaltimento dei rifiuti

   • Autoclavare i rifiuti biologici prima dello smaltimento (parametri: 121°C, 15-20 minuti).

   • Raccolta separata dei rifiuti chimici e smaltimento secondo normativa vigente.

   • Documentare lo smaltimento con certificati appropriati.

7. Emergenze

   • Avere un piano di emergenza per fuoriuscite, esposizioni accidentali o incidenti.

   • Assicurarsi che il kit di primo soccorso sia completo e accessibile.

8. Formazione e Consapevolezza

   • Fare un briefing iniziale su procedure di sicurezza e protocolli di emergenza.

   • Aggiornare il team in caso di cambiamenti nelle procedure o nei materiali.

9. Documentazione

   • Tenere un registro delle attività di sicurezza (controlli DPI/DPC, disinfezioni, smaltimenti).

   • Revisionare periodicamente le procedure per identificare aree di miglioramento.

DPI richiesti nelle esperienze

• Guanti monouso 

• Camice da laboratorio.

• Occhiali di protezione 

• Vetreria sicura

DPC richiesti nelle esperienze

• Contenitori per rifiuti chimici 

• Contenitori per rifiuti biologici

• Autoclave

• Cappa chimica 

• Cappa a flusso laminare

• Meinzer M, Ahmad N, Nielsen BL. Halophilic plant-associated bacteria with plant-growth-promoting potential. Microorganisms. 2023 Dec 2;11(12):2910. doi: 10.3390/microorganisms11122910.

• Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR): cosa sono e come funzionano. BioPills [Internet]. 2023 [citato il 26 Mar 2025]. Disponibile su: https://www.biopills.net/pgpr/

• Vejan P, Abdullah R, Khadiran T, Ismail S, Nasrulhaq Boyce A. Role of Plant Growth Promoting Rhizobacteria in Agricultural Sustainability—A Review. Molecules. 2016;21(5):573.

•  Zeng YH, Koblížek M, Li YX, Liu YP, Feng FY, Ji JD, et al. Long PCR-RFLP of 16S-ITS-23S rRNA genes: a high-resolution molecular tool for bacterial genotyping. J Appl Microbiol. 2013 Feb;114(2):433-47. doi: 10.1111/jam.12057. ​

• Laguerre G, Mavingui P, Allard MR, Charnay MP, Louvrier P, Mazurier SI, et al. Typing of rhizobia by PCR DNA fingerprinting and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of chromosomal and symbiotic gene regions: application to Rhizobium leguminosarum and its different biovars. Appl Environ Microbiol. 1996 Jun;62(6):2029-36. doi: 10.1128/aem.62.6.2029-2036.1996

• Cialli S, Trivellini A, Carmassi G, Incrocci L, Mensuali A. Enhancing agrobiodiversity: designing an in vitro screening protocol for Solanum lycopersicum L. and Solanum pimpinellifolium L. to explore responses to salinity stress. Horticulturae. 2024;10(4):322. doi: 10.3390/horticulturae10040322.

• Sito di Microbiologia Italia (https://www.microbiologiaitalia.it/)

• Storia del pomodoro riccio (https://www.altocasertano.com/antico-pomodoro-riccio-alla-ricerca-del-sapore-perduto/)

• I pomodori campani (https://www.dissapore.com/cucina/pomodori-campani-le-varieta-da-conoscere/)